کلون سازی و بیان ژن هورمون محرک فولیکولی اسبی (efsh) در مخمر پیکیا پاستوریس

پس از آنکه mrna از غده هیپوفیز اسب نژاد توربرد ایرانی استخراج شد، برای سنتز cdna استفاده گردید. هر یک از زیرواحد های پروتئین fsh ، با استفاده از دو جفت آغازگر اختصاصی تکثیر یافتند و سپس بطور جداگانه در حامل ptz57r.t کلون شدند. حامل های نوترکیب به درون سلول باکتری ? dh5منتقل شدند. کلون سازی زیرواحد ها با استفاده از آزمون های تاییدی نظیر واکنش هضم آنزیمی و تعیین توالی، تایید شد. در ادامه توالی های نوکلئوتیدی? و ? از حامل باکتریایی خارج و سپس درون حامل بیانی ppic-9 کلون شدند. دو سازه نوترکیب مجددا در میزبان باکتریایی ? dh5تکثیر یافتند و سپس استخراج گردیدند. سازه نوترکیب ppic-9/fsh? با استفاده از آنزیم برشی sali و سازه نوترکیب ppic-9/fsh? با استفاده از آنزیم برشی saci خطی شدند و بطور همزمان طی فرآیند الکتروپوریشن به درون ژنوم سلول مخمر پیکیاپاستوریس درج گردیدند. سلول های ناقل هر دو زیرواحد با کمک واکنش pcr بر روی ژنوم سلول مخمری تایید و مشخص گردیدند؛ و در محیط کشت بیانی bmmy حاوی متانول کشت داده شدند. نتایج خوانش توالی نوکلئوتیدی زیرواحد fsh? نشان داده است که در ناحیهutr َ 3هورمون مورد مطالعه نسبت به گزارشاتی که تاکنون ثبت شده است، چند تفاوت نوکلئوتیدی مشاهده می شود؛ این تفاوت ها شامل اضافه شدن سه نوکلئوتید در موقعیت 418-413 جفت باز و تغییر یک نوکلئوتید در موقعیت 443 جفت باز می باشد. در این مطالعه، بیان پروتئین نوترکیب fsh اسبی در سیستم ترشحی مخمر پیکیاپاستوریس با استفاده از آزمون های sds-page، وسترن بلاتینگ و رسوب دهی ایمنی تایید شد. این تحقیق نشان داده است که پیکیاپاستوریس سیستم مناسبی برای تولید پروتئین fsh اسبی می باشد و شناسایی پروتئین موردنظر با آنتی بادی اختصاصی نشان دهنده ی انجام اصلاحات پس ترجمه ای صحیح این پروتئین در این سیستم بیانی می باشد