ردیابی و تعیین پراکنش ویروس های amv، bymv و cmv در مزارع یونجه استان سمنان

یونجه یکی از مهم ترین گیاهان علوفه ای کشور و نیز استان سمنان می باشد. عوامل ویروسی متعددی موجب کاهش تولید این محصول می شوند که از آن جمله می توان به ویروس های موزائیک یونجه (alfalfa mosaic virus-amv)، موزائیک معمولی لوبیا (bean common mosaic virus-bcmv)، موزائیک زرد لوبیا (bean yellow mosaic virus-bymv) و موزائیک خیار (cucumber mosaic virus-cmv) اشاره نمود. در این تحقیق، تعداد 31 مزرعه یونجه در پنج شهرستان ایوانکی، گرمسار، سمنان، دامغان و شاهرود از استان سمنان مورد بازدید قرار گرفته و مجموعاً 392 نمونه علائم دار و 663 نمونه تصادفی جمع آوری گردید. این نمونه ها از نظر آلودگی به چهار ویروس مهم یونجه شامل amv، bcmv، bymv و cmv به روش آزمون سرولوژیکی das-elisa و به کمک آنتی بادی اختصاصی (شرکت بیوربا - سوئیس) مورد ارزیابی قرار گرفتند. مهم ترین علائم همراه با نمونه های علائم دار دارای واکنش مثبت در آزمون الایزا، شامل موزائیک و پیسک (4/25 درصد)، پیچیدگی و بدشکلی های برگی (3/31 درصد)، زردی و سبزردی (7/18 درصد) و کاهش رشد یا کوتولگی (6/24درصد) بود. بر اساس نتایج آزمون الایزا در بین 663 نمونه تصادفی، فراوانی آلودگی های ویروسی مورد بررسی به ترتیب عبارت از amv (4/46 درصد)، bcmv (1/8 درصد)، cmv (2/4 درصد) و bymv (1/2 درصد) تعیین شد. همچنین درصد آلودگی به ویروس های مورد بررسی در بین 392 نمونه علائم دار نشان داد که amv با 6/69 درصد بیشترین میزان آلودگی را دارا بود و پس از آن bcmv (16 درصد)، cmv (9/8 درصد) و bymv (8/5 درصد) قرار گرفتند. در این بررسی تعدادی از نمونه های علائم داری که با هیچ یک از آنتی بادیهای فوق واکنش مثبت نداشتند از نظر آلودگی به ویروس کوتولگی سویا (soybean dwarf virus-sbdv) و ویروس کم رشدی بادام زمینی (peanut stunt virus-psv) مورد آزمون سرولوژیک بروش لکه گذاری بافتی (tbia) قرار گرفتند. بر اساس نتایج حاصل از این آزمون، 17 نمونه با آنتی بادی اختصاصی ویروس psv و تعداد 30 نمونه با آنتی بادی اختصاصی sbdv واکنش مثبت داشتند. به منظور تایید نتایج حاصل از آزمون الایزا از آزمون بیولوژیکی و مایه زنی جدایه های ویروسی روی گیاهان محک و نیز ردیابی مولکولی (rt-pcr) به کمک آغازگر های اختصاصی برای ناحیه ژن پروتئین پوششی هر یک از ویروس های مورد نظر انجام گرفت. واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی برای amv، bcmv، bymv، cmv، psv و sbdv منجر به تکثیر قطعات دی.ان.ای بطول مورد انتظار به ترتیب برابر با 860، 1000، 900، 850، 900 و 600 جفت باز گردید. همچنین تهیه نقشه تحدید آنزیمی (rflp) با استفاده از دو آنزیم برشی rsai و smai موید آلودگی نمونه های یونجه به لوتئوویروس sbdv بود. در نتیجه این واکنش قطعه ژنومی 600 جفت بازی تکثیر یافته در مورد جدایه sbdv توسط آنزیم rsai برش خورده و منجر به تولید دو قطعه بطول 200 و 400 جفت بازی گردید ولی با آنزیم برشی smai برشی ایجاد نگردید. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که دو ویروس amv و bcmv از شایع ترین ویروس های آلوده کننده یونجه در مزارع یونجه استان سمنان می باشند. همچنین این اولین گزارش از آلودگی به ویروس های amv، bymv، cmv، psv و sbdv در مزارع یونجه استان سمنان و نیز اولین گزارش از ردیابی مولکولی آلودگی ویروس bcmv از مزارع یونجه کشور می باشد.