بررسی مولکولی حضور برخی ژن های درگیر در بیوسنتز تاکسول در قارچ های اندوفیت سرخدار و بررسی تولید تاکسول در آنها

تاکسول یک داروی ضدسرطان با منشاء گیاهی است که بطور گسترده برای درمان انواع مختلف سرطان استفاده می شود. روش های استخراج سنتی تاکسول از گونه های سرخدار بسیار سخت و هزینه بر است. بنابراین بررسی منابع جایگزین مناسب برای این داروی باارزش ضروری بنظر می رسد. تحقیقات نشان داده است که علاوه بر گونه های سرخدار، تاکسول توسط انواعی از قارچ های اندوفیت این گیاه نیز سنتز می شود. مسیر بیوسنتزی این ماده مشتمل بر حداقل بیست آنزیم است. مسیر بیوسنتزی تاکسول در سرخدار مشخص شده است ولی در قارچ های اندوفیت هنوز شناسایی نشده است. در پژوهش حاضر، قارچ های اندوفیت از پوست درخت سرخدار ایران (taxus baccata) جداسازی و به روش نوک هیف خالص سازی شدند. dna ژنومی از قارچ ها و سرخدار استخراج شده و حضور ژن های ts، dbat و bapt (از ژن های کلیدی درگیر در مسیر بیوسنتزی تاکسول) بوسیله pcr بررسی گردید. توالی بدست آمده از این ژن ها با توالی های مشابه، در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی، همردیف گردید. ساختارهای دوم، سوم و خصوصیات بیوشیمیایی توالی پروتئینی این ژن ها با استفاده از پایگاه های اطلاعاتی و نرم افزارهای بیوانفورماتیکی پیش بینی گردید. ایزوله های قارچی در محیط مایع تخمیری کشت شده و حضور تاکسول در عصاره محیط کشت با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک بررسی گردید. ساختار تاکسول از قارچ های اندوفیت با تاکسول استاندارد با استفاده از طیف سنجی مادون قرمز مورد مقایسه و شناسایی قرار گرفت. پس از خالص سازی، 50 ایزوله قارچی از سرخدار جداسازی شد. استخراج dna ژنومی از ایزوله های قارچی و برگ های سرخدار با کمیت و کیفیت بالا صورت گرفت. از تکثیر ژن ts در سرخدار توالی 1047 نوکلئوتیدی بدست آمد که دارای شباهت بسیار بالایی، در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی، با گونه های دیگر سرخدار بود. این توالی با شماره دستیابی kc188793 در بانک ژن ثبت گردید. نتایج، حضور این ژن را در 19 ایزوله به اثبات رساند. حاصل تکثیر ژن dbat در سرخدار و ایزوله های اندوفیت یک قطعه 125 نوکلئوتیدی بود که دارای شباهت بسیار بالایی باهم و با توالی مربوط به ژن dbat گونه های دیگر سرخدار و دو قارچ اندوفیت شناخته شده مولد تاکسول بود. حضور این ژن در 47 ایزوله از 50 ایزوله کل مشاهده شد. حاصل تکثیر ژن bapt در سرخدار یک توالی 533 نوکلئوتیدی بود که شباهت بالایی با 4 توالی mrna ثبت شده در بانک ژن داشت. این توالی با شماره دستیابی kc218824 در بانک ژن ثبت گردید. این اولین بار است که توالی ژنومی bapt با حضور یک ناحیه اینترونی معرفی می گردد. حضور این ژن در 16 ایزوله قارچی به اثبات رسید. ساختارهای دوم و سوم و خصوصیات توالی پروتئینی هرسه آنزیم با استفاده از پایگاه ها و نرم افزارهای بیوانفورماتیکی پیش بینی شده و نواحی حفاظت شده و موتیف های مهم آنزیم های کد شده بوسیله این ژن ها مشخص گردید. نتایج کروماتوگرافی لایه نازک، تولید تاکسول در 8 ایزوله قارچ اندوفیت را به اثبات رساند. طیف سنجی مادون قرمز یکسان بودن ساختار تاکسول بدست آمده از کشت قارچ های اندوفیت و تاکسول استاندارد را تائید کرد. نتایج نشان داد که قارچ های اندوفیت جداسازی شده از سرخدار ایرانی قادر به تولید تاکسول در محیط کشت بوده و می توانند منبع جایگزین مناسبی جهت تولید این ترکیب باارزش در شرایط آزمایشگاهی به حساب آیند. حضور ژن های کلیدی مسیر بیوسنتزی تاکسول در تعدادی از قارچ ها به اثبات رسید. این نتایج می توانند راهی به سوی دستورزی های ژنتیکی برای بهبود تولید تاکسول باز نمایند.