تعیین ویژگی های مولکولی فایتوپلاسماهای همراه سیب و گلابی در استان اصفان

فایتوپلاسماها به عنوان یکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده بیماری در روی درختان میوه در سراسر جهان گسترش زیادی داشته و خسارات فراوانی به این محصولات وارد می کنند. طی سال های اخیر در مناطقی از استان اصفهان علایم جاروک، تغییر شکل برگ و میوه ها، رشد گوشوارک ها و ضعف و کم رشدی در درختان سیب و لوله شدن برگ، قرمز شدن برگ ها و زوال و کم رشدی درختان گلابی مشاهده شد که با علایم بیماری های فایتوپلاسمایی شباهت داشت. به منظور شناسایی و گروه بندی فایتوپلاسماهای آلوده کننده درختان سیب وگلابی استان اصفهان، استخراج dna از رگبرگ و دمبرگ نمونه های جمع آوری شده از درختان مشکوک صورت گرفت و برای ردیابی فایتوپلاسما از واکنش pcr با جفت آغازگر های عمومی ناحیه 16s rrna فایتوپلاسمایی استفاده شد. در واکنش pcr دور اول برای ردیابی فایتوپلاسما در این نمونه ها، جفت آغازگر های p1/p7 و p1a/p7a استفاده شدند. با استفاده از آغازگر p1/p7 در تعداد محدودی از نمونه ها قطعه bp 1784 تکثیر شد و بقیه نمونه ها باندی تولید نکردند، ولی استفاده از آغازگر p1a/p7a منجر به تکثیر قطعه bp 1759 در تعداد بیشتری از نمونه ها شد. در ادامه کار، برای تکثیر نواحی مشخصی از قسمت داخلی ناحیه 16s-23s rrna تکنیک nested-pcr با استفاده از دو جفت آغازگر r16f2n/r16r2 و r16f1(x)/r16r1(x) به کار گرفته شد. استفاده از جفت آغازگر r16f2n/r16r2 در nested-pcr بعد از pcr اول با جفت آغازگرهای p1/p7 و p1a/p7a منجر به تکثیر قطعه bp 1239 در تعداد زیادی از نمونه های جمع آوری شده در اواخر تابستان و اوایل پاییز شد، ولی تکثیر قطعه مورد نظر فایتوپلاسمایی در نمونه های بهاره و اوایل تابستان موفقیت آمیز نبود. ترکیب جفت آغازگر p1a/p7a به عنوان جفت آغازگر pcr دور اول و r16f2n/r16r2 در دور دوم بهترین روش ردیابی فایتوپلاسماهای سیب و گلابی ارزیابی گردید. با توجه به اهمیت گروه شاخه انبوهی سیب در بروز بیماری های فایتوپلاسمایی سیب و گلابی از جفت آغازگر r16f1(x)/r16r1(x) اختصاصی این گروه در واکنش nested-pcr استفاده شد که قطعه bp 1100 در هیچکدام از نمونه های سیب آلوده به فایتوپلاسما مشاهده نگردید در حالی که این قطعه در نمونه های گلابی آلوده تکثیر شد. با توجه به عدم حضور فایتوپلاسماهای گروه شاخه انبوهی سیب، در سیب و به منظور شناسایی جدایه های عامل بیماری در سیب و گلابی جمع آوری شده، از آزمون pcr-rflp جدایه ها استفاده شد. به این منظور یک قطعه bp 1239 از ناحیه داخلی ژن 16s rrna فایتوپلاسمایی جدایه ها با استفاده از آغازگر r16f2n/r16r2 در واکنش nested-pcr تکثیر شد و سپس این قطعه توسط آنزیم های برشی rsai ,haeiii ,hpaii, taqi و hhai(cfoi) مورد هضم آنزیمی قرار گرفت. نتایج نشان داد که جدایه های فایتوپلاسمایی متنوعی در ایجاد بیماری فایتوپلاسمایی سیب و گلابی نقش دارند. بر اساس این آزمون، جدایه های سیب در دو گروه و جدایه های گلابی در چند گروه طبقه بندی شدند که تعدادی از آنها به عنوان نماینده برای تعیین توالی نوکلئوتیدی انتخاب گردیدند. مقایسه توالی های نوکلئوتیدی این جدایه ها با توالی های موجود در بانک ژن نشان داد که توالی جدایه های مورد مطالعه، 99%-100% با توالی فایتوپلاسمایی ثبت شده در بانک ژن جهانی (ncbi) مشابهت دارند. بررسی توالی های بدست آمده مشخص نمود که جدایه های فایتوپلاسمایی در سیب متعلق به دو گونه candidatus. phytoplasma. asteris و ca. p. aurantifolia می باشند. گونه ca. p. mali که در اروپا به عنوان مهمترین عامل فایتوپلاسمایی سیب شناخته شده است، در باغات سیب استان ردیابی نشد. از طرف دیگر، گونه ca. p. pyri عامل اصلی بیماری زوال گلابی در باغات گلابی استان شناخته شد، هرچند تعدادی جدایه ca. p. asteris و یک جدایه گونه ca. p. prunorum عامل ایجاد بیماری زردی هسته دارها به عنوان فایتوپلاسماهای همراه گلابی در این تحقیق شناسایی شدند. با توجه به حضور گونه ca. p. pyri در باغات گلابی می توان آن را به عنوان شایع ترین عامل فایتوپلاسمای گلابی معرفی کرد که در دنیا نیز مهمترین عامل بیماری زوال گلابی گزارش شده است. بر اساس توالی یابی ژن پروتئین ریبوزومی (rp) با استفاده از آغازگر rp (i)f1a/rp (i)r1a جدایه ها ی aster yellows سیب وگلابی در زیر گروه rp-b قرار گرفتند. نتایج این تحقیق نشان داد، امکان همراهی فایتوپلاسماها از گروه های فایتوپلاسمایی مختلف در درختان سیب و گلابی وجود دارد که احتمالاً تغذیه یک ناقل مشترک در روی گیاهان یکساله و درختان سیب و گلابی سبب انتشار این عوامل بیماری زا می گردد. واژگان کلیدی: سیب، گلابی، فایتوپلاسما، گروه شاخه انبوهی سیب، آنالیز pcr-rflp ، تعیین توالی نوکلئوتیدی