ساخت سازه دارای ژن فعال کننده پلاسمینوژن بافتی انسانی (t-pa) جهت انتقال به قارچ دکمه ای سفید (agaricus bisporus)

قارچ دکمه ای سفید agaricus bisporus یکی از مهمترین قارچ های خوراکی در دنیا به شمار می رود، اما به دلیل ساختار ژنتیکی و نوع زندگی ای که دارد اصلاح آن با روش های مرسوم با مشکلاتی همراه است. از طرفی شباهت سیستم گلیکوزیلاسیون قارچ دکمه ای سفید با سلول های پستانداران سبب گردیده تا این قارچ به عنوان کارخانه زیستی جهت تولید پروتئین های نوترکیب گلیکوزیله، از جایگاه قابل توجهی برخوردار گردد و نیاز به استفاده از روش های نوین مانند مهندسی ژنتیک در بهبود این قارچ را پر رنگ تر کند. از جمله پروتئین های گلیکوزیله، می توان به فعـال کننده پلاسمینوژن بافتی انسانی که توسط ژن t-pa کد می شود، اشاره نمود. در این تحقیق ژن t-pa موجود در پلاسمید ptz57r توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز جداسازی شد. پیشبر gpdii نیز با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز بر روی dna دو نژادim008 و هلند 737 قارچ دکمه ای سفید تکثیر گردید. توالی ترشحی ژن لاکاز1 و اینترون شماره 7 ژن gpdii قارچ دکمه ای سفید نیز به صورت تک رشته ای سنتز شدند. پلاسمیدهای pgli8 و pgli7 با وارد کردن پیشبر، اینترون و توالی ترشـحی در پلاسمیدpbluescript sk+ ، ایجاد شدند. با قرار دادن پیشبر gpdii نژاد im008 پیش از ژن گزینشگر hph و همینطور با انتقال پیشبرgpdii به همراه توالی ترشحی و اینترون موجود در پلاسمیدهای pgli8 و pgli7 پیش از ژن gus-gfp در پلاسمید pcambia1304، پلاسمیدهای p13h88 و p13h87 به وجود آمدند. سپس با جایگزینی ژن t-pa به جای ژن gus-gfp موجود در این دو پلاسمید، پلاسمید های p13h88t وp13h87t ایجاد شدند. پلاسمیدهای pgli8 و pgli7 مورد توالی یابی واقع شدند. نتایج توالی یابی نشان دادند که این دو پیشبر تفاوت اندکی با هم دارند و قطعات پیشبری، اینترون و توالی ترشحی به درستی به هم متصل شده اند.