کلونینگ و بیان قطعات نوترکیب هم‎پوشان متوالی پروتئین ns3 ویروس اسهال ویروسی گاو در اشریشیا کلی و ارزیابی آن‎ها در الایزا

بیماری اسهال ویروسی گاو (bvd)، یکی از بیماری‎های مهم گاو است که با اسهال، سقط جنین، مرده‎زایی، بازگشت به فحلی و کاهش تولید شیر، خسارت‎های اقتصادی هنگفتی را سبب می‎شود. این بیماری توسط ویروس اسهال ویروسی گاو (bvdv) از خانواده فلاوی‎ویریده و از جنس پستی‎ویروس‎ ایجاد می‎شود. برنامه‎های مراقبتی مناسب مانند جستجوی سرولوژیکی آنتی‎بادی‎های تولید شده بر ضد ویروس bvd، اهمیت زیادی در پیشگیری و کنترل این بیماری دارند. تشخیص سرمی بر اساس بررسی آنتی‎بادی‎های تولید شده بر ضد پروتئین غیرساختمانی 3 (ns3) ویروس که در میان سویه‎های ویروس bvd حفاظت شده است، می‎تواند برای نشان دادن آلودگی دام‎های گله با این ویروس استفاده گردد. هدف از انجام این مطالعه کلونینگ و بیان قطعات متوالی هم‎پوشان پروتئین ns3 و بررسی میزان ایمنی‎زایی و حساسیت و ویژگی آن‎ها در الایزا و بررسی احتمال وجود قطعه‎ای از پروتئین ns3 بود که دارای مشخصات ذکر شده قابل مقایسه با پروتئین کامل ns3 باشد، تا بتوان امکان استفاده از این ناحیه از ns3 را به جای مولکول کامل ns3 به عنوان آنتی‎ژن الایزا برای تشخیص آنتی‎بادی‎های ضد ویروس bvd مورد آزمایش قرار داد. بدین منظور توالی کامل کدکننده پروتئین ns3 ویروس bvd سویه nadl از نوکلئوتید 5423 تا 7471 (2049 جفت‎ باز، 683 اسید آمینه) با آزمایش rt-pcr تکثیر و به درون وکتور بیانی پروکاریوتی pmal-c2x کلون شد و به داخل باکتری اشریشیا کلی سویه bl21 ترانسفورمه گردید. پس از تعیین و تأیید توالی پلاسمید نوترکیب حاوی توالی کدکننده ns3، 6 قطعه متوالی هم‎پوشان ns3 با استفاده از پلاسمید خالص شده به عنوان الگوی dna و روش pcr تکثیر داده شدند، به درون وکتور بیانی پروکاریوتی pmal-c2x کلون شدند و به داخل باکتری اشریشیا کلی سویه bl21 ترانسفورمه گردید. کلیه‎ی پروتئین‎های نوترکیب بیان شده در اشریشیا کلی با کمک ستون کروماتوگرافی رزین- آمیلوز خالص شدند و قطعات بیان شده ns3 در کنار پروتئین کامل آن در الایزا ارزیابی شدند. نتایج نشان داد که قطعه چهارم (f4) پروتئین ns3 از بیشترین ایمنی‎زایی نسبت به دیگر قطعات برخوردار است، هرچند حساسیت این قطعه در مقایسه با پروتئین کامل ns3 بسیار کمتر بود. با استفاده از پروتئین‎های نوترکیب ns3 کامل و قطعه f4 به عنوان آنتی‎ژن تشخیصی، دو الایزای مختلف جهت بررسی حضور آنتی‎بادی‎های تولید شده بر ضد ویروس bvd در سرم گاوها، طراحی گردید و به ترتیب تعداد 400 و 94 نمونه سرمی با این الایزاها مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت نتایج بدست آمده از این الایزاها با یکدیگر و با نتایج حاصل از بررسی همین نمونه‎های سرمی با کیت الایزای تجاری و تست خنثی‎سازی ویروس مقایسه شدند. نتایج آزمون‎های آماری نشان داد که میزان توافق و حساسیت و ویژگی نسبی الایزای طراحی شده با ns3 کامل در مقایسه با تست خنثی‎سازی ویروس و کیت الایزای تجاری، بسیار بیشتر از الایزای طراحی شده با قطعه f4 در مقایسه با این دو روش می‎باشد. با توجه به نتایج آزمون‎های کیفی و کمی ارائه شده، نشان داده شد که علی‎رغم مطلوب بودن شاخص‎های نسبی الایزای f4، این الایزا نسبت به الایزای طراحی شده ns3، از حساسیت و ویژگی لازم برای تشخیص عفونت bvdv برخوردار نیست و از آنجا که پروتئین نوترکیب ns3 تولید شده نیز به کمک mbp به صورت محلول و به میزان مطلوبی، به راحتی در سیستم پروکاریوتی تولید شد، استفاده از پروتئین کامل ns3 و الایزای طراحی شده با آن نسبت به الایزای f4، کاملاً ارجحیت دارد. این یافته‎ها حاکی از آن بود که الایزای طراحی شده ns3، آزمایشی حساس و اختصاصی است و می‎تواند به عنوان یک کیت الایزای تشخیصی تولید داخل کشور، در امر تشخیص و بررسی‎ سرواپیدمیولوژیکی بیماری bvd به منظور پیشگیری و کنترل این بیماری و کاهش و یا جلوگیری از خسارات اقتصادی ناشی از آن به صنعت دامداری و دامپروری کشور مورد استفاده قرار گیرد.