آنالیز کاربردی مولکولی دو عامل رونویسی nac به منظور کشف شبکه تنظیمی کنترل کننده پیری گیاه

پیری یک فرآیند طبیعی نموی وابسته به انرژی است که توسط برنامه ژنتیکی خود گیاه کنترل می شود و با تغییر در بیان بسیاری از ژن ها همراه است. عوامل رونویسی نقش اساسی در تنظیم فرآیندهای دخیل در این مرحله ی نموی ایفا می کنند. مکانیسم های کنترل رونویسی منجر به بیان متمایز ژن هایی می شود که نقش مهمی در هماهنگی فرآیند پیری بر عهده دارند. شناسایی ژن هایی که باعث آغاز این فرآیند و کنترل آن می شوند، برای کنترل صحیح پیری جهت اهداف اقتصادی ضروری است.مطالعات گذشته نشان داده است که اعضای خانواده nac نقش اساسی در کنترل پیری و مکانیسم های وابسته دارند. هدف از اجرای این تحقیق تهیه سازه هایی با بیان القایی و بیان دائمی شامل دو ژن از این خانواده با شناسه ژنتیکیat3g12910 و at1g61110 است که به این صورت امکان شناسایی ژن ها و شبکه ی تنظیمی پایین دست این عوامل رونویسی فراهم می گردد. برای این منظور ابتداrna از اندام های مختلف گیاه آرابیدوپسیس استخراج وcdna این اندام ها ساخته شد. سپس به منظور تکثیر ژن های مذکور، واکنشpcr با استفاده از cdna اندام مختلف به عنوان الگو انجام گردید. سپس دو ژن عامل رونویسی در ناقل حدواسط pjet همسانه سازی شدند. پس از یافتن و تائید کلون مثبت توسط هضم آنزیمی و توالی یابی، ناقل pjet نوترکیب، ناقل per8 و همچنین ناقل pgreen با آنزیم های برشی مناسب برش داده شدند و پس از تخلیص قطعات و غلظت سنجی، فرایند اتصال انجام گردید. محصول اتصال طی فرایند تراریزش به روش شوک حرارتی به سلول های مستعد e.coli سویه dh5?انتقال داده شد. سپس سازه های نام برده به سلول های مستعد agrobacterium سویهgv3101 به روش شوک الکتریکی بازتراریزش شد و کلونی های مقاوم توسط کلونی pcr تایید گردیدند. در مرحله بعد تراریزش گیاه آرابیدپسیس توسط باکتری های اگروباکتریوم واجد سازه مورد نظر به روش نفوذ در مرحله ی غنچه دهی انجام شد.سپس بذور تراریخت احتمالی جمع آوری گردید. بذور تراریخت احتمالی سازه per8 ضد عفونی شد و در محیط کشت حاوی هیگرومایسین کشت گردید. همچنین بذور تراریخت احتمالی سازه pgreen به طور مستقیم در خاک و تحت تیمار علف کش باستا کشت شدند.گیاهچه های مقاوم به گلدان منتقل شده و پس از گذشت 3 هفته نمونه برگی تهیه شد. نمونه های حاوی سازه ی per8 تحت تیمار زمانی استرادیول قرار گرفت. از نمونه های برگی rna استخراج شد و پس از حذف dna ژنومی، cdna تک رشته ای ساخته شد. سپس qrtpcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی دو ژن انجام شد. نتایج حاکی از بیان شدید ژن های مورد نظر در سازه pgreen نسبت به شرایط کنترل بود. همچنین القای شدید و چند برابری ژن مورد نظر تحت تیمار استرادیول در سازه per8 در مقایسه با شرایط کنترل حاکی از کارکرد کامل سازه ی القایی per8 در گیاه بود. همچنین آزمایشات فوق به طور کامل بر گیاهچه های نسل بعد مربوط به سازه ی at3g12910-per8 با سه تیمار زمانی دو، پنج و ده ساعت نیز انجام شد که بر موفقیت کامل سازه مورد نظر صحه گذاشت. لذا می توان از این گیاهان نوترکیب جهت شناسایی شبکه های پایین دستی تحت تثیر ژن مذکور استفاده کرد .