همسانه سازی و بیان ژن fsh گاوی در مخمر pichia pastoris

هورمون محرک فولیکول گاوی (fsh) به خانواده هورمون های گلیکوپروتئینی تعلق دارد که از غده هیپوفیز یا جفت ترشح می شوند. این هورمون یک هترو دایمر می باشد که از زیر واحد آلفا (مشترک در همه هورمون های گلیکوپروتئینی) و زیر واحد بتا (اختصاصی هر هورمون) تشکیل شده است. fsh گاوی در تکنولوژی تولید مثل، مانند سوپراوولاسیون حیوانات مزرعه ای و درمان سندرم پلی سیستیک تخمدان استفاده می شود. همچنین این هورمون برای اهدف بالینی، دامپزشکی و درمان ناباروری کاربرد دارد. تکنولوژی dna نوترکیب ابزار مفیدی جهت تولید fsh عاری از آلودگی های هورمونی، پریونی و ویروسی فراهم می کند. تولید پروتئین نوترکیب در سیستم های بیان یوکاریوتیک مثل pichia pastoris یک روش مطمئن برای تولید fsh گاوی با اهداف درمانی است. همچنین شناسایی پروتئین تولید شده به صورت نوترکیب، توسط آنتی بادی ویژه، صحیح بودن ساختار تغییرات پس از ترجمه پروتئین را تایید می کند. هدف این تحقیق تولید هورمون fsh گاوی در سیستم بیانی pichia pastoris بود. برای این منظور orf کد کننده دو زنجیره آلفا و بتای ژن fsh گاوی به طور جداگانه در وکتور ptz57r/t کلون شد سپس در وکتور بیانی ppic9 ساب کلون گردید و در نهایت توسط واکنش pcr و تعیین توالی تایید شد. دو پلاسمید نوترکیب حاوی زنجیره آلفا و بتا به ترتیب با آنزیم های محدود کننده sali و saci که ایجاد فنوتیپ his+ mut+ gs115 می کنند، خطی شدند. محصول ایجاد شده داخل سلول مستعد مخمر با الکتروپوریشن کوترانسفکت شد و حضور آن در سلول توسط pcr تایید گردید. در ادامه چند کلون جهت بررسی بیان انتخاب شد. سپس، رسوب سلولی کلون های انتخابی در محیط bmmy سوسپانسیون شد و به مدت 4 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد قرار گرفت. در طول دوره انکوباسیون، متانول به عنوان القاگر با حجم نهایی 5/0 درصد هر 24 ساعت اضافه شد و هر 6 ساعت نمونه برداری انجام گردید. بیان هورمون fsh گاوی بصورت نوترکیب در محلول رویی و رسوب سلولی مخمر، با تکنیک pcr و وسترن بلات تایید شد.