جداسازی و همسانه سازی توالی رمز کننده آنزیم cel ii از گیاه کرفس (apium graveolens)

روش های متعددی برای آشکارسازی جهش های تک نوکلئوتیدی ابداع گردیده است. اندونوکلئاز cel ii یک گلیکوپروتئین خارج سلولی است که از گیاه کرفس متعلق به خانواده چتریان جداسازی شده است. این آنزیم از قابلیت تکنیکی بسیار مطلوب در برش dna هترودوپلکس برخوردار است که آن را بسیار ارزشمند می نماید. جنبه های کاربردی آنزیم cel ii در مطالعات جهش های نقطه ای، تقاضای جهانی قابل توجهی را برای آن بوجود آورده و با توجه به اهمیت این آنزیم، این تحقیق با هدف دست یابی به اطلاعات توالی رمز کننده mrna این آنزیم و همسانه سازی این توالی از گیاه کرفس انجام پذیرفت. در واقع انجام این تحقیق به عنوان گام اول در راستای تولید cel ii نوترکیب در ایران، امری مهم بود. برای کلون کردن ژن cel ii پس از استخراج rna و سنتز cdna، قطعه ژن cel ii تکثیر شد. پس از تهیه پلاسمید ptz57r/t، واکنش لیگاسیون انجام شد و پس از تهیه سلول های مستعد پذیرش پلاسمید، محصول واکنش لیگاسیون جهت آزمایش کلنینگ به کار برده شد. از آن جایی که پلاسمید ptz57r/t دارای ژن مقاومت به آمپی سیلین می باشد، پس از انجام واکنش کلنینگ باکتری های e.coli سویه dh5? در محیط کشت جامد حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین کشت داده شدند. از رسوب های حاوی ماده x-gal و iptg جهت تشخیص کلنی هایی که cdna مربوط به ژن cel ii وارد شده به پلاسمید ptz57r/t را دریافت نمودند استفاده شد. جهت تایید اولیه صحت همسانه سازی، پس از کشت خطی کلنی های سفید در محیط کشت جامد حاوی آمپی سیلین، واکنش colony pcr جهت تایید وجود قطعه cdna درون پلاسمید ptz57r/t انجام گرفت. سپس جهت بررسی بیشتر و تایید نهایی همسانه سازی، پلاسمید استخراج شد و برای تعیین توالی بصورت رفت و برگشت با پرایمرهای عمومی ارسال شد. هر دو توالی تعیین شده از دو سر قطعه کلون شده با توالی گزارش شده همردیف گردید و مشخص شد که هر دو توالی خوانده شده مربوط به ژن cel ii می باشد و با آن همولوژی کامل دارد.