کلونینگ و بیان ژن فیتاز (phyc) در اشرشیاکلی

فیتازها(مایواینزیتول هگزا فسفات فسفوهیدرولاز) آنزیم های هستند که اسید فایتیک را هیدرولیز و فسفر معدنی را برای حیوانات قابل دسترس می کنند.تولید طبیعی و نوترکیب این آنزیم ازجمله مسائل مهم حوزه مهندسی ژنتیک محسوب می گردد. در این پروژه، ژن فیتاز خارج سلولی باکتری باسیلوس سابتیلیسatcc12711(phyc) با استفاده از پرایمرهای لینکردار حاوی سایت های برشی bamhi و hind iii جداسازی شد. به منظور انجام توالی یابی و بررسی خصوصیات، ژن تکثیر شده phyc به ناقل ptz57r/tمنتقل و سپس به باکتری اشرشیاکلیdh5? انتقال داده شد. غربالگری کلونی آبی و سفید با استفاده از iptg و x-galبه منظور انتخاب کلونی های نوترکیب انجام گردید و کلونی های حاوی ژن هدف با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و روش کلونی pcr انتخاب شدند. آنالیز و بررسی همولوژی ژن هدف با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیک صورت گرفت. هضم آنزیمی وکتور کلونینگ با استفاده از آنزیم های محدودکننده ذکر شده صورت گرفت. ژن هدف به ناقل بیانی pet32a(+) به منظور بیان ژن وارد شد. ناقل نوترکیب به سویه اشرشیاکلیbl21 (de3) انتقال و حضور ناقل نوترکیب با استفاده از کلونی pcr تایید گردید. سپس سویه بیانی حاوی ژن هدف با استفاده از iptg در غلظت نهایی 1 مولار در حضور cacl2 10 میلی مولار تحریک شد. نتایج استخراج پروتئین در sds-page الکتروفورز شده و اندازه پروتئین فیتاز تولید شدهkd 64 تخمین زده شد. همچنین نتیجه دات بلات صحت تولید پروتئین فیتاز را تایید می نماید. اندازه گیری فعالیت آنزیمی با استفاده از روش استاندارد فسفاتاز نشان داد که آنزیم نوترکیب تولید شده در این تحقیق، در 7ph= بیشترین فعالیت را دارا می باشد. فعالیت آنزیم اندازه گیری شده برابر با u/ml 44/7 بود که وابسته به حضور یون کلسیم می باشد. تحقیقات نشان می دهد که این آنزیم به جهت مقاومت حرارتی و هزینه تولید پایین،قابلیت بالای برای استفاده در صنعت مواد افزودنی و دارویی دارد.