تاثیر مواد محرک بر میزان تولید تبائین در گیاه papaver bracteatum lindl. در شرایط درون شیشه ای

خشخاش ایرانی با نام علمی papaver bracteatum lindl. از تیره papaveraceae یکی از گیاهان دارویی بسیار مهم می باشد. این تحقیق به منظور بهینه سازی شرایط رشد سلول های p. bracteatum lindl. در کشت سوسپانسیون و همچنین تاثیر محرک ها و پیش ماده ال-تیروزین بر مقدار تبائین تولید شده در شرایط درون شیشه ای (توسط سلول های سوسپانسیون) انجام گرفت. به منظور تولید کالوس، ریزنمونه های هیپوکوتیل-کوتیلدون در محیط کشت پایه موراشیگ و اسکوک حاوی سطوح مختلف تنظیم کننده های رشد گیاهی کشت شده و در اتاقک رشد با دمای 20 درجه سانتیگراد در تاریکی نگهداری شدند. صفات درصد کالوس زایی، درصد کالوس قهوه-ای و وزن تر کالوس اندازه گیری شد. به منظور استقرار کشت سوسپانسیون، کالوس های تولید شده به محیط کشت ms مایع حاوی یک میلی گرم بر لیتر 2,4-d، 1/0 میلی گرم بر لیتر کینتین و 15 میلی گرم بر لیتر اسید اسکوربیک منتقل و روی شیکر اوربیتال با دور 120 دور در دقیقه نگهداری شدند. اثر سطوح مختلف تنظیم کننده های رشد گیاهی (2,4-d، naa و bap یا کینتین) روی تکثیر سوسپانسیون سلولی مورد بررسی قرار گرفت. پس از اعمال تیمارهای رشد، صفات تعداد سلول ها در یک میلی لیتر، scv و pcv با فواصل زمانی یک هفته ای، و پس از تکمیل رشد سلول ها نیز صفات وزن تر و خشک سلول ها، ph و ec محیط کشت اندازه گیری شدند. برای بررسی اثر مواد محرک و پیش ماده ال-تیروزین در غلظت های مختلف بر مقدار تبائین تولید شده در شرایط درون شیشه-ای، تیمارهای متیل جاسمونات، کیتوسان، اسید سالیسیلیک، امواج فراصوت و ال-تیروزین بر سلول های کشت سوسپانسیون اعمال شده و مقدار تبائین در دو، چهار و شش روز پس از اعمال تیمار با استفاده از تکنیک hplc مورد اندازه گیری قرار گرفت. نتایج نشان داد که در بین محیط های کشت از نظر درصد کالوس زایی و وزن تر کالوس اختلاف معنی داری وجود دارد. بیشترین درصد کالوس زایی در محیط کشت ms حاوی یک یا دو میلی گرم بر لیتر 2,4-d، 1/0 یا 2/0 میلی گرم بر لیتر کینتین و 15 میلی گرم بر لیتر اسید اسکوربیک مشاهده گردید. همچنین بیشترین مقدار وزن تر کالوس در محیط کشت ms حاوی 1 میلی گرم بر لیتر 2,4-d به همراه 1/0 میلی گرم بر لیتر کینتین و 15 میلی گرم بر لیتر اسید اسکوربیک بدست آمد. علاوه بر این، نتایج نشان داد که استفاده از اسید اسکوربیک (به مقدار 15 میلی گرم بر لیتر) باعث جلوگیری از قهوه ای شدن کالوس ها و در نتیجه بهبود رشد کالوس می شود. بین تیمارهای تنظیم کننده رشد گیاهی اعمال شده در کشت سوسپانسیون از نظر شاخص های تعداد سلول در یک میلی لیتر، scv، pcv، وزن تر و خشک سلول، ph، و ec محیط کشت اختلاف معنی داری وجود داشت. محیط کشت مناسب برای رشد سلول ها، محیط کشت ms پایه حاوی یک میلی-گرم بر لیتر naa، یک میلی گرم بر لیتر bap و 15 میلی گرم بر لیتر اسید اسکوربیک بود. تعداد سلول در یک میلی لیتر، scv، pcv، وزن تر و خشک سلول، ec و ph محیط کشت در این تیمار به ترتیب 106×7/16، 89/28%، 69/27%، 5/118 گرم در لیتر، 44/10 گرم در لیتر، 57/2 میلی زیمنس و 18/7 بود. منحنی رشد سلول ها نشان داد که با گذشت زمان تعداد سلول در میلی لیتر، مقدار scv و pcv افزایش یافته است. تکثیر سلول ها تا 12 روز بعد از کشت کند و ناچیز بوده و بعد از آن به شدت افزایش یافت و تراکم سلولی 42 روز پس از کشت به حداکثر مقدار خود رسیدند. پس از این مدت رشد سلول ها احتمالا به دلیل تخلیه عناصر غذایی و تنظیم کننده های رشد گیاهی موجود در محیط کشت و یا افزایش مقدار مواد فنلی در محیط کشت متوقف شده و تراکم سلولی محیط کشت تقریبا ثابت مانده است. نتایج حاصل از تجزیه واریانس صفات اندازه گیری شده در تیماری های محرک و پیش ماده ال-تیروزین نشان داد که بین تیمارهای محرک از نظر محتوای تبائین سلول ها، وزن سلول فریزدرای شده و ph محیط کشت و بین زمان های مختلف نمونه برداری از نظر محتوای تبائین سلول ها، ph و ec محیط کشت اختلاف معنی داری وجود داشت. اثر متقابل تیمار محرک در زمان نمونه برداری نیز برای محتوای تبائین سلول ها و ph محیط کشت معنی دار بود. در بین تیمارهای محرک اعمال شده تیمار متیل جاسمونات با غلظت 100 میکرومولار به همراه 2 میلی مولار ال-تیروزین در روز ششم پس از اعمال تیمار بیشترین محتوای تبائین سلول ها را با میانگین 01/64 میلی گرم بر گرم وزن خشک داشت که 77/47 برابر بیشتر از محتوای تبائین تولید شده در محیط کشت شاهد (34/1 میلی گرم بر گرم وزن خشک) بود. به دنبال آن تیمارهای محرک اسید سالیسیلیک با غلظت 75 میلی گرم بر لیتر در روز چهارم پس از اعمال تیمار، اسیدسالیسیلیک 75 میلی گرم بر لیتر در روز ششم پس از اعمال تیمار،پیش ماده ال-تیروزین با غلظت یک میلی مولار در روز ششم پس اعمال تیمار و امواج فراصوت به 20 ثانیه شش روز پس از اعمال به ترتیب با میانگین 18/47، 89/32، 83/28 و 18/28 میلی گرم بر گرم وزن خشک قرار داشتند که به ترتیب 8/45، 54/24، 51/21 و 03/21 برابر بیشتر از محتوای تبائین سلول-های شاهد در همان زمان ها بود.