تخلیص آنزیم آلژینات لیاز از یک باکتری تخریب کننده آلژینات

pseudomonas aeruginosa باکتری بیماری زای فرصت طلبی است که عامل عفونت های متنوعی در بیماران با سیستم ایمنی تضعیف شده است. تواناییp.aeruginosa در ایجاد عفونت های مزمن مرتبط با بیوسنتز آلژینات است که پلیمری پلی ساکاریدی متشکل از واحد های ?-d-mannuronic acid با پیوند های 1به 4 می باشد که با واحد های ?-l-guluronic acid در آن پراکنده شده است. آلژینات می تواند انتشار آنتی بیوتیک های مشخصی را به سلول محدود کند و همچنین می تواند مکانیسم های دفاعی ضد میکروبی مهم میزبان را مهار کند که این علت اصلی مقاومت آنتی بیوتیکی p.aeruginosa است. آلژینات لیاز پیوند های گلیکوزیدی میان واحدهای اورونیت را با مکانیسم حذف بتا می شکند و قند غیر اشباع تولید می کند بنابراین آلژینات لیاز آنزیم تخریب کننده آلژینات است. آنزیم آلژینات لیاز در مسیر بیوسنتز آلژینات نقش دارد و با کاهش طول آلژینات و ایجاد پرایمر در تولید آلژینات توسط آنزیم های دیگر عمل می کند. در این تحقیق هدف تخلیص نسبی آنزیم آلژینات لیاز از باکتری p.aeruginosa سویه 214 بود که به دلیل توانایی تولید مقادیر بالایی از آلژینات و تشکیل کلونی های موکوئیدی مورد استفاده قرار گرفت و کاندیدای خوبی برای تهیه آنزیم آلژینات لیاز بود. برای بررسی ترشحی بودن آنزیم آلژینات لیاز از محیط کشت حداقل با منبع کربن آلژینات و کدورت سنجی استفاده شد که جواب منفی بود سپس برای مشخص کردن پری پلاسمیک بودن جایگاه آنزیم از روش شوک دمایی استفاده گردید که منجر به استخراج آنزیم شد. سه روش برای تعیین فعالیت آنزیم آلژینات لیاز استفاده شد. دو روش کمی شامل سنجش جذب در پرتو های فرابنفش با طول موج 232 نانومتر و روش سنجش تیوباربیتوریک اسید در طول موج 548 نانومتر می باشد. در روش کیفی سیستم پلی آکربل آمید ژل الکتروفورز غیر دناتوره کننده استفاده شد که در نهایت روش تیوباربیتوریک اسید به دلیل حساسیت بالا انتخاب شد. آنزیم آلژینات لیاز در غلظت027/0 میلی گرم بر میلی لیتر از سدیم آلژینات فعالیت خوبی را از خود نشان داد و فعالیت بهینه طی 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد تعیین گردید و نهایتا برای خالص سازی نسبی این آنزیم از روش ترسیب آمونیوم سولفات و ستون کروماتوگرافی تعویض یونی deae-sepharose cl-6b استفاده شد.