تخلیص و تعیین برخی خصوصیات آنزیم آمیلاز از قارچ آسپرژیلوس نایجر

تخلیص و تعیین برخی خصوصیات آنزیم آمیلاز از قارچ آسپرژیلوس نایجر چکیده گلوکوآمیلاز یک اگزو آنزیم است که در مقیاس بزرگی در تبدیل نشاسته به قند، دکسترین ها یا گلوکز در صنایخ غذایی استفاده می شود. گلوکوآمیلاز عمدتاً توسط قارچها تولید می شود و آسپرژیلوس نایجر یکی از تولید کنندگان این آنزیم است که در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت. هدف از انجام این مطالعه استفاده از یک روش بسیار ساده کروماتوگرافی تعویض یونی جهت خالص نمودن گلوکوآمیلاز از مایع رویی محیط کشت آسپرژیلوس نایجر است. آسپرژیلوس نایجر در محیط مایع تشکیل شده از 300 میلی لیتر عصاره تهیه شده از 600 گرم سیب زمینی که در 1 لیتر آب مقطر پخته شده و حاوی گلوکز 20، آمونیوم سولفات 6/6، کلسیم کلرید 1، پتاسیم دی هیدروژن فسفات 5/3، فروس سولفات هپتا هیدرات 1/0، منیزیم سولفات هپتا هیدرات 1/0، نشاسته 5 (گرم بر لیتر) با ph 6 کشت شد و در دمای c°30 انکوبه گردید. گلوکوآمیلاز با استفاده از ستون کروماتوگرافی deae- سفاسل و کلرید سدیم 0 تا 5/0 مولار خالص سازی شد. وزن مولکولی این آنزیم با الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید در حضور سدیم دودسیل سولفات 10% (sds-page) سنجیده شد. تأثیرات ?-مرکاپتواتانول، دما و اوره بر ساختمان آنزیم به وسیله الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید در حضور سدیم دودسیل سولفات بررسی شد. pi آن با استفاده از روش ایزوالکتروفوکوسینگ تعیین شد و همچنین دما و ph بهینه فعالیت آنزیم و تأثیرات غلظت 5 میلی مولار برخی از یون های فلزی بر غعالیت و پایداری آنزیم بررسی شد. مقدار km و vmax و kcat آنزیم برای غلظت های مختلف نشاسته محلول به عنوان سوبسترا، برای 20 دقیقه فعالیت در دمای c°40 سنجیده شد. محصول نهایی فعالیت آنزیم به وسیله روش کروماتوگرافی لایه نازک آنالیز شد. طی نتایج بدست آمده، وزن مولکولی این آنزیم در الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید در حضور سدیم دودسیل سولفات (sds-page) تقریباً 100-105 کیلودالتون گزارش شد. تأثیر ?-مرکاپتواتانول، دما و اوره بر ساختمان فضایی آنزیم تغییراتی در وزن مولکولی آنزیم، از جمله وزن های متفاوت 62 و 85 و 90 و 100-105 کیلو دالتون را نشان داد. pi آن در روش ایزوالکتروفوکوسینگ برابر با 3/4 تعیین شد. همچنین دما و ph بهینه فعالیت آنزیم به ترتیب c°70 و 5 بود و تأثیرات غلظت 5 میلی مولار برخی از یون های فلزی نشان داد که یون های نقره ag، کلسیم ca، روی zn، منیزیم mg، کادمیوم cd و نیز چیلاتور فلزی edta بر فعالیت آنزیم ناچیز است، ولی یونهای جیوه hg و آلومینیوم alو آهن fe به ترتیب بیشترین اثر مهار کنندگی را بر فعالیت آنزیم داشتند. مقدار km و vmax و kcat آنزیم برای نشاسته محلول به عنوان سوبسترا، به ترتیب 02933/0± 3332/0 میلی گرم بر میلی لیتر و 487/1± 105 واحد آنزیمی بر میلی لیتر در دقیقه و 5/158013 بر ثانیه بود. فعالیت گلوکوآمیلازی آنزیم خالص شده پس از هضم نشاسته محلول با استفاده از روش کروماتوگرافی لایه نازک تأیید شد و نشان داد که آن یک آنزیم قند ساز است و تنها محصول تولید شده توسط آن، گلوکز است. نتایج بیانگر آن است که اهداف مورد نظر این مطالعه محقق شده است. گلوکوآمیلاز طی یک مرحله کروماتوگرافی خالص سازی شد و خصوصیات آنزیم خالص شده نشان داد که این آنزیم توانایی و پتانسیل استفاده در صنایع غذایی را دارد. واژگان کلیدی: گلوکوآمیلاز، آسپرژیلوس نایجر، کروماتوگرافی، الکتروفورز.