جداسازی و پاتوتایپینگ ملکولی جدایه های ویروس نیوکاسل ولوژنیک گله های ماکیان استان خراسان رضوی

بیماری نیوکاسل، یکی از مهمترین بیماری های عفونی پرندگان به ویژه ماکیان است که باعث خسارات اقتصادی وسیعی در صنعت مرغداری می گردد. عامل این بیماری، پارامیکسوویروس تیپ یک ماکیان (apmv-1) و عضوی از خانواده ی پارامیکسوویریده است. این ویروس به نام ویروس بیماری نیوکاسل نیز موسوم می باشد. علاوه بر روش های مرسوم ارزیابی حدت جدایه ها، تعیین حدت توسط روش های ملکولی نیز قابل انجام می باشد. در این راستا، حدت ویروس به وسیله ی تعیین توالی آمینواسیدی ناحیه ی شکافت پروتئین فیوژن صورت می پذیرد. این ناحیه بین اسید آمینه های شماره ی 112 تا 117 قرار گرفته است. سویه های بدون حدت دارای دو اسید آمینه ی بازی در این ناحیه بوده و اسید آمینه ی شماره ی 117 لوسین می باشد در حالی که سویه های دارای با حدت بالا، دارای بیش از دو اسید آمینه ی بازی در ناحیه ی فوق بوده و اسید آمینه ی شماره ی 117 نیز فنیل آلانین می باشد. با توجه به شیوع این بیماری در 18 ماه گذشته در اکثر نقاط کشور، بر آن شدیم تا ویروس یا ویروس های در گردش در گله های طیور استان خراسان را جداسازی، تعیین هویت و مورد ارزیابی پاتوتایپینگ ملکولی و بررسی فیلوژنی قرار دهیم. جهت انجام این کار، نمونه گیری از مغز 10 لاشه ی مرغ گوشتی و تخم گذار مشکوک به بیماری نیوکاسل از مناطق مختلف استان خراسان رضوی و شهرستان بیرجند صورت گرفت. نمونه ها پس از جمع آوری و هموژن کردن در محیط حاوی آنتی بیوتیک و ضد قارچ، به تخم مرغ جنین دار 11-9 روزه ی عاری از ویروس بیماری نیوکاسل تزریق شدند. تخم مرغ ها روزانه به مدت یک هفته توسط دستگاه کاندلینگ بررسی شدند و مایع آلانتوئیک جنین های تلف شده جمع آوری و به وسیله ی آزمون های هماگلوتیناسیون (ha) و ممانعت از هماگلوتیناسیون (hi) با سرم حاوی آنتی بادی اختصاصی، ارزیابی شدند. rna مایع آلانتوئیک نمونه های مثبت استخراج و پس از تبدیل شدن به cdna توسط پرایمرهای اختصاصی پوشش دهنده ی ناحیه ی شکافت پروتئین فیوژن، تکثیر شدند. سپس 6 محصول pcr از ژل آگارز برش زده شدند و پس از خالص سازی، توالی یابی گردیدند. در نهایت کروماتوگرام خام توالی های نوکلئوتیدی پس از ویرایش مورد ارزیابی های پاتوتایپینگ ملکولی قرار گرفتند. توالی های نوکلئوتیدی حاصله نیز پس از همسان سازی چند گانه (multiple alignment) با توالی های همسنگ در بانک های اطلاعات ژنی، مورد ارزیابی فیلوژنتیک قرار گرفتند. براساس نتایج حاصله، علی رغم تفاوت های اندک در ناحیه ی تکثیر شده ی ژن فیوژن، تمام جدایه ها واجد توالی آمینواسیدی 112-rrqkrf-117 در ناحیه ی شکافت پروتئین فیوژن بودند. با توجه به وجود بیش از دو اسید آمینه ی بازی در این ناحیه و حضور اسید آمینه ی فینل آلانین در موقعیت شماره ی 117 و نیز با عنایت به تابلوی بالینی و کالبدگشایی و سیمای هیستوپاتولوژیک، ویروس بیماری نیوکاسل دخیل در واگیری های اخیر منطقه و احتمالا کشور، متعلق به پاتوتیپ ویسروتروپیک ولوژنیک ارزیابی گردید. از نظر فیلوژنی نیز تمامی جدایه های ویروس بیماری نیوکاسل در نقاط مختلف استان و همچنین شهرستان بیرجند، از یک منشا واحد و در کلاس ii، ژنوتیپ vii و تحت ژنوتیپ d (viid) در کنار جدایه هایی از چین و تایوان قرار گرفتند. این جدایه ها در تقسیم بندی ویروس های بیماری نیوکاسل براساس دودمان (lineage) نیز در دودمان 5 و تحت دودمان d (5d) واقع شدند.