ردیابی و تعیین پراکنش سه ویروس مهم موزاییک یونجه، موزاییک زرد لوبیا و موزاییک خیار بیماریزای شبدر در استان گیلان

در ایران محصولات علوفه ای از جمله انواع شبدر (trifolium spp.) از اهمیت اقتصادی قابل توجهی برخوردار بوده و در اغلب مناطق به ویژه در استان گیلان مورد کشت و کار قرار می گیرند. سطح کشت این محصول در کل کشورحدود 78000 هکتار و مقدار تولید آن 6/1 میلیون تن در سال می باشد. سطح کشت انواع شبدر در استان گیلان 758 هکتار و مقدار تولید آن 4300 تن در سال می-باشد. از جمله عوامل بیماریزای انواع شبدر، می توان به عوامل ویروسی اشاره نمود که علاوه بر کاهش عملکرد، موجب کاهش کیفیت علوفه تولیدی نیز می شوند. شناسایی بیماری های ویروسی و تعیین پراکنش و فراوانی آنها یکی از اولین و مهمترین گام ها در راستای مدیریت خسارت این بیماری ها محسوب می شود. در خصوص ردیابی و تعیین فراوانی و پراکنش بیماری های ویروسی شایع در مزارع شبدر استان گیلان تا قبل از این تحقیق هیچ بررسی و مطالعه ای به عمل نیامده بود. در این تحقیق، تعداد 10 مزرعه شبدر در چهار شهرستان آستانه، فومن، لاهیجان و ماسال از استان گیلان مورد بازدید قرار گرفته و مجموعا 571 نمونه شامل (135 نمونه علائم دار و 436 نمونه تصادفی) جمع آوری گردید. نمونه های جمع آوری شده از نظر آلودگی به چهار ویروس مهم موزائیک یونجه، موزائیک معمولی لوبیا، موزائیک زرد لوبیا و موزائیک خیار به روش آزمون سرولوژیکی das-elisa و به کمک آنتی بادی اختصاصی (شرکت بیوربا - سوئیس) مورد ارزیابی قرار گرفتند. مهمترین علائم همراه با 74 نمونه علائم دار دارای واکنش مثبت در آزمون الایزا، شامل موزائیک و پیسک (8/38 درصد)، پیچیدگی و بدشکلی های برگی (9/20 درصد)، زردی و سبزردی (3/28 درصد) و کاهش رشد یا کوتولگی (9/11درصد) بود. بر اساس نتایج آزمون الایزا در بین 135 نمونه علائم دار، فراوانی آلودگی های ویروسی مورد بررسی بترتیب عبارت از bymv (7/20 درصد)، amv (5/18درصد)، cmv (8/11 درصد) و bcmv (7/3 درصد) بود. همچنین درصد آلودگی به ویروس های مورد بررسی در بین 436 نمونه تصادفی نشان داد که amv با 3/16 درصد بیشترین و پس از آن bymv (4/14 درصد)، cmv (1/12 درصد) و bcmv (4/3 درصد) قرار گرفتند. در بین مزارع شبدر مورد بررسی و نمونه های تصادفی جمع آوری شده، شهرستان لاهیجان با 7/48 درصد دارای بیشترین میزان آلودگی ویروسی بوده و مزارع شبدر شهرستان های آستانه، فومن و ماسال بترتیب با 5/47، 3/46 و 2/44 درصد در رتبه های بعدی قرار داشتند. در این بررسی تعداد 61 نمونه علائم دار با هیچیک از آنتی-بادی های فوق واکنش مثبت نداشتند. این نتایج نشان دهنده احتمال وقوع دیگر عوامل ویروسی یا عوامل شبه ویروسی در نمونه های مورد بررسی می باشد. از بین این نمونه ها، چهارده نمونه انتخاب و از نظر آلودگی به ویروس موزائیک آرابیس و ویروس پژمردگی لکه ای گوجه فرنگی مورد آزمون الایزا قرار گفتند. بر اساس نتایج حاصل از این آزمون، دو نمونه (جمع آوری شده از لاهیجان) با آنتی بادی اختصاصی ویروس armv و تعداد سه نمونه (یک نمونه از لاهیجان و دو نمونه از آستانه) با آنتی بادی اختصاصی tswv واکنش مثبت داشتند. به منظور تایید نتایج حاصل از آزمون الایزا تعدادی از جدایه های ویروسی انتخاب شده و دامنه میزبانی آنها مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج حاصل از این مطالعات تایید کننده نتایج بدست آمده از آزمون های سرولوژیکی الایزا بود. همچنین با توجه به فراوانی نسبی دو ویروس bymv و amv، ردیابی مولکولی این دو ویروس به کمک آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز به روش رونوشت برداری برگردان مورد بهینه سازی قرار گرفت. با استفاده از واکنش آر.تی.پی.سی.آر و بکمک آغازگر های اختصاصی، در مورد ویروس amv قطعه دی.ان.ای بطول حدود 670 جفت باز و در مورد ویروس bymv قطعه دی.ان.ای بطول حدود 900 جفت باز تکثیر شد. هر دو این قطعات مربوط به ناحیه ژن پروتئین پوششی ویروس های مذکور بودند. همچنین به منظور کاهش هزینه های آزمون، امکان ردیابی توام هر دو ویروس amv و bymv بطور همزمان در یک نمونه با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز (duplex pcr) مورد بهینه سازی قرار گرفت. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که دو ویروس bymv و amv از مهمترین ویروس های آلوده کننده شبدر در مزارع شبدر استان گیلان می باشند. همچنین این اولین گزارش از حضور آلودگی به سه ویروس bymv، cmv و tswv در مزارع شبدر استان گیلان و نیز گزارش وقوع دو ویروس bcmv و armv برای اولین بار از مزارع شبدر کشور می باشد.