کاربرد بیوترانسفورماسیون میکروبی برای تولید وانیلین و دیگر متوکسی فنل های باارزش

گرایش جوامع بشری برای مصرف فرآورده های معطر طبیعی موجب ترغیب محققین در استفاده از بیوکاتالیزورهای میکروبی برای سنتز محصولات معطر طبیعی گردیده است. دو روش عمده دستیابی به وانیلین طبیعی شامل استخراج مستقیم از منابع گیاهی و بیوترانسفورماسیون میکروبی می باشد. با توجه به کاربرد گسترده وانیلین و افزایش روزافزون تقاضا برای مصرف وانیلین طبیعی و همچنین از آنجایی که استخراج از منابع گیاهی بسیار پرهزینه و زمان بر بوده و به تنهایی قادر به تامین بازارهای جهانی نمی باشد، بنابراین لزوم توسعه فرآیندهای بیوتکنولوژیک جایگزین مناسب الزامی می باشد. در این پژوهش، که برای اولین بار در ایران صورت پذیرفته، کاربرد بیوترانسفورماسیون میکروبی در ایجاد وانیلین طبیعی و دیگر متوکسی فنل های باارزش از پیش سازهای فنیل پروپانوئیدی (ایزواوژنول، اوژنول و فرولیک اسید) مورد مطالعه قرار گرفته است. جداسازی و تشخیص سویه های میکروبی تولید کننده وانیلین گام نخست در انتخاب سویه های برتر برای تولید بیوتکنولوژیک وانیلین است. در این راستا، در یکسری آزمایشات غربالگری 211 سویه باکتریایی و مخمری از محیط های مختلف در ایران جدا گردید. تحمل پذیری سویه های جدا شده نسبت به سوبستراهای فنیل پروپانوئیدی و وانیلین به روش های رقت در آگار و میکروپلیت الایزا تعیین شد. غربالگری اولیه با استفاده از آنالیزهای tlc و hplc انجام شد. سویه های منتخب از نظر صفات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی و همچنین فیلوژنی و ملکولی شناسایی و تعیین توالی شدند. غلظت وانیلین و دیگر متوکسی فنل های تولید شده در مخلوط واکنش های بیوترانسفورماسیون بوسیله انواع روش های اسپکتروفتومتری و کروماتوگرافی از جمله gc-fid و hplc مورد سنجش قرار گرفت. در بخش نخست از این کار پژوهشی، از میان 82 سویه باکتری تجزیه کننده ایزواوژنول، سویه باکتری pseudomonas sp. kob10 که دارای بیشترین تولید وانیلین (1.81 گرم در لیتر با راندمان مولی 13 درصد) پس از 60 ساعت واکنش بیوترانسفورماسیون بود، جهت مطالعات بهینه سازی انتخاب شد. پس از بهینه سازی های انجام شده با روش های تک فاکتوری و روش آماری تاگوچی غلظت وانیلین تولیدی در سلول های رویشی سویه مذکور به 3.14 گرم در لیتر (راندمان مولی 22.5 درصد) پس از 60 ساعت واکنش بیوترانسفورماسیون افزایش یافت. در قسمت دیگری از این کار تحقیقی، برای اولین بار جداسازی و شناسایی میکرواورگانیسم های نمک دوست با پتانسیل بیوکانورژن ایزواوژنول به وانیلین مورد مطالعه قرار گرفته است. براساس نتایج بدست آمده، از میان 36 سویه نمک دوست غربالگری شده، سلول های در حال استراحت سویه تحمل کننده نمک psychrobacter sp. csw4 دارای بیشترین تولید وانیلین (1.28 گرم در لیتر با راندمان مولی 13.8 درصد) پس از 48 ساعت واکنش، تحت شرایط غیر بهینه شده بود. پس از بهینه سازی با استفاده از تکنیک های طرح آماری تاگوچی و روش صفحه پاسخ (rsm) غلظت وانیلین تحت شرایط سلول های در حال استراحت سویه مذکور به 2.67 گرم در لیتر (راندمان مولی 44.3 درصد ) پس از 24 ساعت واکنش بیوکانورژن افزایش یافته است. در بخش دیگری از این کار تحقیقی، برای اولین بار شناسایی سویه های مخمری با قابلیت تبدیل ایزواوژنول به وانیلین و وانیلیک اسید مورد مطالعه قرار گرفته است. براساس نتایج بدست آمده، از میان 50 سویه مخمری غربالگری شده، سلول های در حال استراحت سویه مخمری candida galli pgo6 دارای بیشترین تولید وانیلین (راندمان مولی 48 درصد) و وانیلیک اسید (راندمان مولی 19 درصد) پس از 30 ساعت واکنش بیوترانسفورماسیون بود. بررسی همزمان آنالیزهای uv، tlc و hplc تحت شرایط سلولهای در حال استراحت سویه مخمری pgo6 منجر به شناسایی دو متابولیت اصلی (وانیلین و وانیلیک اسید) حاصل از بیوکانورژن ایزواوژنول شد. براساس نتایج بدست آمده مسیرمتابولیسمی احتمالی ایزواوژنول در سویه مخمری pgo6 ترسیم شده است. در قسمت دیگری از این پژوهش، در راستای شناسایی سویه های باکتری با قابلیت تجزیه کنندگی سوبسترای اوژنول به متابولیت های باارزش وانیلین و وانیلیک اسید، 16 سویه باکتری غربالگری شدند و برای اولین بار بیوترانسفورماسیون اوژنول به وانیلین و وانیلیک اسید در سویه بومی pseudomonas resinovorans spr1 گزارش گردید. نتایج نشان داد که بیشترین میزان تولید وانیلین (0.24گرم در لیتر با راندمان مولی 10.3 درصد) و وانیلیک اسید (12/1 گرم درلیتر با راندمان مولی 43.7 درصد) پس از به ترتیب30 و 60 ساعت از شروع واکنش بیوترانسفورماسیون تحت سلولهای در حال استراحت سویه مذکور حاصل شده است. در ادامه این مطالعه متابولیت های اصلی حاصل از کاتابولیسم اوژنول در سلول های در حال استراحت سویه غربالگری شدهspr1 با استفاده از آنالیزهای همزمان tlc و hplc تشخیص داده شده و مسیر متابولیسمی احتمالی اوژنول در سویهspr1 ترسیم شده است. در بخش دیگری از این کار تحقیقی، با هدف شناسایی سویه های باکتری با توانایی تجزیه کنندگی سوبسترای فرولیک اسید، 27 سویه باکتری غربالگری شدند و برای اولین بار تولید موثر متابولیت های وانیلیک اسید و وانیلین در در سویه ای ازbacillus licheniformis shl1 گزارش گردید. براساس نتایج بدست آمده، سلول های در حال استراحت سویه shl1 توانایی بیوکانورژن 1 گرم فرولیک اسید را به 494 میلی گرم در لیتر وانیلیک اسید (با راندمان مولی60 درصد) پس از گذشت 45 ساعت از آغاز واکنش بیوکانورژن دارا می باشد. در قسمت دیگری از این پژوهش، کلونینگ ژن های شناخته شده مسیر کاتابولیسمی فرولیک اسید در شاتل وکتور بیانی pnz8048 به منظور تولید وانیلین نوترکیب مورد مطالعه قرار گرفته است. پلاسمید نوترکیب pnz8048-t5/ech/fcs این امکان را فراهم ساخت که بتوانیم دو ژن fcs و ech را در شاتل وکتور بیانی pnz8048 تحت کنترل پروموتور فاژی t5 در سیستم میزبانی streptococcus thermophilus بطور موفقیت آمیز کلون و بیان کنیم. براساس نتایج بدست آمده، سلول های در حال استراحت سویه مهندسی شده s. thermophilus dsm20617t قادر به تبدیل فرولیک اسید به وانیلین با راندمان مولی 62 درصد پس از 12 ساعت واکنش بیوترانسفورماسیون و وانیلیل الکل با راندمان مولی 18 درصد پس از 16 ساعت، تحت شرایط سلول های در حال استراحت بود. مطالعه اخیر نخستین گزارش از کاربرد باکتری های پروبیوتیک مهندسی شده در تولید وانیلین نوترکیب است. در نهایت، وانیلین طبیعی تولید شده به روش بیولوژیک در مقایسه با وانیلین استاندارد با استفاده از روش های uv، ftir، xrd و اسپکتروسکوپی جرمی مورد شناسایی قرار گرفت. با مقایسه راندمان های وانیلین و وانیلیک اسید حاصل از این تحقیق با سایر مطالعات صورت گرفته در ارتباط با بیوترانسفورماسیون پروپنیل بنزن ها، می توان امیدوار بود که سویه های بومی غربالگری شده، بعنوان بیوکاتالیزورهای میکروبی کارآمد، انتخاب مناسبی برای تولید وانیلین و وانیلیک اسید طبیعی باشند.