بیان گلیکوپروتئین غشایی (ha) ویروس آنفلوآنزا درe. coli نوترکیب

ویروس آنفلوآنزا که عامل مولد یکی از بیماریهای حاد تنفسی می باشد در غشا خود واجد گلیکوپروتئین مهمی به نام همآگلوتینین است. این مولکول ضمن اینکه اصلی ترین آنتی ژن برای القا پاسخ ایمنی بر علیه ویروس است، همواره به عنوان مدل ایده آلی برای مطالعه فرآیندهای بیولوژیکی مهم از جمله گلیکوزیلاسیون مورد استفاده قرار گرفته است. گلیکوزیلاسیون ( به ویژه از نوع n) متداولترین تغییر ضمن یا پس از ترجمه ای پروتئینها در سلولهای یوکاریوتی است بطوریکه تقریبا 70% داروها و واکسنهای پروتئینی از نوع n- گلیکوپروتئینها هستند. معمولا برای تولید فرم نوترکیب این پروتئینها از سیستمهای بیانی یوکاریوتی مختلف نظیرمخمرها، سلولهای پستانداران نظیر cho و سلولهای حشرات مانند sf9 استفاده می گردد که هر کدام دارای مزایا و معایب خاص خود می باشند. این سلولها با توجه به امکانات آنزیمی سیستم گلیکوزیلاسیون خود ساختارهای گلیکانی مختلفی را به مولکولهای پروتئینی می افزایند که بر عملکرد این مولکولها به ویژه آنتی ژنیسیته تاثیرگذار می باشند. بنابر این تولید گلیکوپروتئینها به فرم گلیکوزیله در باکتری اشریشیاکلی نوترکیب، که قابلیت مهندسی مسیر گلیکوزیلاسیون در آن وجود داشته باشد، از اهمیت خاصی برخوردار است. با توجه به اینکه، اهمیت گلیکوپروتئین همآگلوتینین ویروس آنفلوآنزا ( به ویژه زیر واحد بزرگ آن ha1) به عنوان آنتی ژن کلیدی برای تولید واکسن آنفلوآنزا به اثبات رسیده است، لذا در این تحقیق زیر واحد بزرگ وآنتی ژنیک مولکول همآگلوتینین(ha1) دراین اشریشیاکلی نوترکیب بیان گردید. برای این منظور ابتدا قطعه ژنی کد کننده زیر واحد بزرگ پروتئین همآگلوتینین به کمک روش reverse transcription-polymerase chain reaction از ویروس استاندارد با تیتر مناسب جداسازی وتکثیر گردید و پس از تعیین ترادف در وکتور بیانی pet22b با پپتید هدایتگر pelb کلون شد. پس ازتایید بیان پروتئین به وسیله sds-page و western blotting در لیزات سلولی و فضای پری پلاسمی، واکنش پذیری آن با آنتی سرم استاندارد ویروسی سنجیده و با آنتی ژن ویروسی استاندارد، مقایسه گردید. سپس با استفاده از سازه حامل سیستم گلیکوزیلاسیون باکتری کامپیلوباکتر ژژونی، باکتری اشریشیاکلی نوترکیب تهیه و پروتئین ha1 ویروس آنفلوآنزا در آن بیان گردید. پروتئین بیان شده در هر دو باکتری از نظر گلیکوزیلاسیون مورد ارزیابی قرار گرفت و با استفاده از روش لکتین بلاتینگ و مهار آن، گلیکوزیلاسیون ha1 درباکتری نوترکیب تایید شد.