همسانه سازی، انتقال و بررسی بیان ژن پروانسولین انسانی در گیاه کاهو (lactuca sativa l.)

دیابت بیماری است که بدن نمی تواند انسولین تولید کند یا به درستی از آن استفاده کند. اگرچه انسولین عموماً در باکتری یا مخمر برای استفاده تجاری تولید می شود اما در حال حاضر تحقیقات بر روی روش های دیگر تولید از جمله تولید پروتئین انسولین در گیاهان متمرکز شده است. گیاه کاهو (lactuca sativa l.) یک گیاه مناسب برای تولید پروتئین های نوترکیب و بویژه واکسن های خوراکی می باشد. این گیاه یکی از عمده ترین سبزی های برگی بوده و متعلق به خانواده asteraceae می باشد. در این مطالعه با استفاده از آغازگرهای مخصوص و روش pcr، ژن پروانسولین انسانی تکثیر شد. ژن تکثیر شده از روی ژل جداسازی و با آنزیم های خاص برش داده شد و در ناقل pcambia1304 همسانه سازی گردید. ناقل ساخته شده با روش های مختلف تأیید گردید. مهندسی ژنتیک کاهو به یک روش موثر و قابل اتکا کشت بافت نیاز دارد. برای این منظور، عوامل مختلف موثر بر باززایی کوتیلدون های کاهو از قبیل ژنوتیپ، سن ریزنمونه و غلظت های مختلف تنظیم کننده های رشد بررسی شدند. بالاترین میزان کالوس زایی در غلظت 7/2 میکرو مولار naa و 4/4 میکرو مولار ba بدست آمد. بالاترین میزان نوساقه زایی در غلظت های کم ba اتفاق افتاد. شرایط بهینه ای برای تراریخته سازی از هم کشتی نمونه های کوتیلدونی با اگروباکتریوم در محیط ms بدون هیچ گونه هورمون رشدی به مدت 48 ساعت بدست آمد. بعد از مرحله هم کشتی، نمونه های کوتیلدونی روی محیط کشت انتخابگر حاوی هیگرومایسین و سفوتاکسیم کشت شدند. بعد از انتقال کوتیلدون ها به محیط انتخابگر و پس از چند بار واکشتی ریزنمونه ها، گیاهان کاهوی تراریخت بدست آمدند. با استفاده از آنالیز pcr و southern blotting، حضور قطعه t-dna حاوی ژن پروانسولین انسانی در ژنوم کاهو اثبات گردید و همچنین انجام rt-pcr نسخه برداری از روی این ژن را تأیید نمود. آنالیز گیاهان تراریخته در سطح پروتئین با بهره گیری از آزمون های elisa و ایمونوبلاتینگ وجود پروتئین در گیاهان تراریخت را تأیید کردند. در ادامه این پروژه انتقال ژن پروانسولین به هسته گیاه توتون و کلروپلاست آن انجام شده است که مراحل آنالیز گیاهان توتون تراریخت شده هسته ای و کلروپلاستی در حال انجام است.