بهینه سازی انتقال ژن به قارچ بیماری زای گیاهی fusarium graminearum

هدف اصلی و اولیه این مطالعه, بهینه سازی انتقال ژن به قارچ بیماریزای گیاهی fusarium graminearum بود که عامل اصلی بیماری بلایت فوزاریومی سنبله (fhb) در غلات دانه ریز است. تراریخت کردن ژنتیکی، نه تنها ابزاری مفید جهت شناسایی ژنوم و مطالعه عملکرد آنها در بیمارگرهای گیاهی است, بلکه زمینه مطالعه برهمکنش گیاه - بیمارگر و راهکار لازم برای مقابله با بیماری را فراهم می کند. علاوه براین, تراریختی قارچ ها زمینه تنظیم بیان و اصلاح ژن ها را در جهت تولید مواد و ترکیبات صنعتی از جمله: آنزیم ها, اسیدها, متابولیت های ثانویه و ترکیبات دارویی مهیا می سازد. به طور کلی برای تراریخت کردن قارچ های رشته ای چهار روش: protoplast/peg, تفنگ ژنی, الکتروپوریشن و تراریختی بواسطه آگروباکتریوم پیشنهاد شده است.در این مطالعه, تراریخت کردن قارچ f. graminearum توسط دو روش protoplast/peg و تفنگ ژنی از نوع helios gene gun و با دو پلاسمید pdl2 و pbi121 بهینه سازی شد. از آنجا که قارچ f. graminearum در محیط های خاصی اسپورزایی می کند و برای شروع تراریختی در هر دو روش به تعداد زیادی اسپور (ماکروکنیدی) نیاز است, چهار محیط کشت cl, sn, mung bean, simple medium مورد آزمایش قرار گرفتند. با بررسی نتایج محیط simple mediumبعنوان محیط اسپورزایی نهایی انتخاب شد. مطلوب ترین شرایط برای تولید پروتوپلاست، ، استفاده از 106×5/2 اسپور که برای 6 ساعت جوانه زده بودند و 3 ساعت در 10 میلی لیتر آنزیم قرار گرفته بودند، مشخص گردید. تعداد بیش از 106 پروتوپلاست با استفاده 30% peg و 10 میکروگرم از dnaپلاسمیدی تراریخت شد. ذرات تنگستن با قطر متوسط 7/0 و1/1 میکرون که توسط dna پوشیده شده بودند در تراریختی, بافت های هدف ماکروکنیدی ها و میسلیوم های قارچ f. graminearum با روش تفنگ ژنی helios gene gun استفاده شدند. برای انتقال کمپلکس میکروذرات/, مناسب ترین پارامترها از نظر نوع و اندازه میکروذرات, , فشار گاز هلیوم بین 50 تا 100 psi متغییر بود و غلظت pvp نیز صفر بود. در نهایت, تکثیر ژن مقاومت به هیگرومایسین (hph)بوسیله pcr و همچنین ردیابی egfp بوسیله میکروسکوپ فلورسانس و سنجش gus , صحت تراریخت بودن همسانه های بدست آمده را تایید کرد.