ساخت ژن فیتوکلاتین سنتزی و کلونینگ آن در میزبان پروکاریوتی

پروتئین های متصل شونده به فلز نقش مهمی در پایداری ساختمان، سیگنالینگ، انتقال، کنترل متابولیسم و هموستازی فلزات ایفا می کنند. پپتیدها و قطعات پروتئینی با اندازه های مختلف، در زنجیره های جانبی خود دارای چندین گروه عملکردی هستند که برای اتصال به فلز مناسب هستند .از سوی دیگر برخی فلزات سنگین مانند روی و مس ریز مغذی های ضروری برای یکسری از فرایندهای فیزیولوژیکی هستند. مقادیر زیاد این فلزات و دیگر یون های فلزات سنگین غیر ضروری مثل کادمیوم، سرب و جیوه برای سلولها بسیار سمی هستند. از این رو ارگانیسم های عالی در پاسخ به حضور فلزات سنگین، پپتیدهای غنی از سیستئین مانند گلوتاتیون، فیتوکلاتین و متالوتیونین را تولید می کنند. این پپتیدها به یون های فلزی نظیر کادمیوم، جیوه، مس، سرب متصل شده و آن ها را به فرم غیر فعال از نظر زیستی تبدیل می کنند. همانطور که اشاره شد، فیتوکلاتین ها دسته ای از پپتیدهای متصل شونده به فلزات هستند که تحت عنوان متالوتیونین های دسته iii طبقه بندی می شوند. این پپتید در انواع زیادی از گونه های گیاهی (نظیر تک لپه ایها، دولپه ایها، بازدانگان و جلبک ها)، گونه های قارچی مختلف و در دیاتوم های آبزی شناسایی شده است. اما این پپتید در هیچ گونه جانوری شناسایی نشده است. فیتوکلاتین ها به دلیل ویژگی های ساختاری منحصر به فردشان به ویژه داشتن واحدهای تکرار شونده پیوسته glu-cys? مزایای بیشتری نسبت به متالوتیونین ها دارند. به طوری که فیتوکلاتین ها توانایی جذب بیشتر یون های فلزی را نسبت به متالوتیونین دارند در واقع ساختار این پپتید به صورت. glu-cys)ngly?)،n=2-11 است. دسته دیگر از پپتیدهای متصل شونده به فلزات فیتوکلاتین های سنتزی با ساختار کلی (glu-cys)ngly هستند که ساخت ژن کد کننده این پپتید و کلون سازی آن، مبنای مطالعات این رساله می باشد. بررسی ها اثبات کرد که فیتوکلاتین های سنتزی با ظرفیت دو برابری نسبت به متالوتیونین ها به فلزات متصل می شوند از سوی دیگر جدا سازی وتخلیص فیتوکلاتین ها از گیاهان یا دیگر ارگانیسم ها کاری خسته کننده و زمان بر می باشد از این رو استفاده از فیتوکلاتین های سنتزی بسیار کارآمد و مناسب می باشد. در این پپتیدها برخلاف فیتوکلاتین ها پیوند بین گلوتامات و سیستئین از نوع آلفا می باشد بنابراین این پپتید از طریق ریبوزم قابل سنتز می باشد. با توجه به کارایی فیتوکلاتین سنتزی در جذب فلزات سنگین در این مطالعه این نوع پپتید انتخاب گردید. از سوی دیگر برای افزایش جذب فلز، توالی فیتوکلاتین سنتزی توسط لینکر مارپیچی به طول 11 رزیدو به توالی هگزاهیستیدین (که قادر به جذب فلز می باشد) متصل گردید تا فیوژن پروتئین حاصل نسبت به فیتوکلاتین سنتزی به تنهایی به طور کاراتر در جذب فلز نقش داشته باشد. برای اطمینان از انتخاب لینکر، پپتید حاصل (شامل فیتوکلاتین سنتزی لینکر و هگزاهیستیدین) مورد شبیه سازی دینامیک مولکولی قرار گرفت. پس از تایید لینکر انتخابی توسط شبیه سازی دینامیک مولکولی، به ساخت ژن فیتوکلاتین سنتزی به همراه لینکر و هگزا هیستیدین پرداخته شد به طوری که کل این توالی در هشت اولیگونوکلئوتید که در 18 تا 19 جفت باز هم پوشانی داشتند، طراحی شدند. این اولیگونوکلئوتیدها به همراه آنزیم t4 dna ligase جهت ساخت ژن مورداستفاده قرار گرفتند، ژن موردنظر پس از ساخت در وکتورptz57r/t انتقال یافت و در باکتری اشریشیاکلی(dh5?) کلون گردید. در نهایت نتایج تعیین توالی نشان داد که دو نوع فیتوکلاتین سنتزی(ec4 , ec11) به همراه لینکر و هگزاهیستیدین ساخته شده و در وکتور مذکور کلون گردیده است.