تاثیر تنش خشکی روی فعالیت آنزیم نیتروژناز در همزیستی حساس و مقاوم به خشکی نخود – ریزوبیوم

تثبیت بیولوژیکی نیتروژن مهمترین مسیر طبیعی برای وارد کردن نیتروژن به درون بیوسفر است. یکی از مهمترین جایگاه های تثبیت نیتروژن در درون گرهک است که روی ریشه گونه های لگوم از همزیستی بین گیاه میزبان و باکتری و یا در غیر لگوم ها از همزیستی گیاهان اکتینوریزال با فرانکیا تشکیل می شود. همزیستی لگوم–ریزوبیوم و یا اکتینوریزال ها – فرانکیا بر اساس تبادل کربن/نیتروژن بین گیاه میزبان و باکتری است. خشکی یکی از عوامل بازدارنده تثبیت نیتروژن است که تولید محصول در لگوم ها را در مناطق خشک و نیمه خشک جهان محدود می کند. به هر حال، شناخت دقیق عوامل محدود کننده و بازدارنده فرایند تثبیت نیتروژن تحت تنش خشکی به افزایش محصولات لگوم از طریق بهبود فرایند تثبیت نیتروژن کمک می کند. چندین مکانیسم در ممانعت فرایند تثبیت نیتروژن تحت تنش خشکی پیشنهاد شده است: قابلیت دسترسی به اکسیژن، تنظیم فیدبکی نیتروژن و محدودیت کربن. در این تحقیق تاثیر تنش خشکی روی فعالیت آنزیم نیتروژناز و سرعت تثبیت نیتروژن در گرهک های حاصل از همزیستی گیاه نخود رقم بیونیچ با سویه های ریزوبیوم c-15، cp-31 و cp-36 انتخاب شده از آزمایشات مقدماتی مورد بررسی قرار گرفت و عوامل موثر در بازداشته شدن فرایند تثبیت نیتروژن در گرهک های نخود مورد بررسی قرار گرفت برای این منظور فعالیت آنزیم های مسیر متابولیسم کربن و نیتروژن، غلظت ساکاروز، غلظت آمینواسیدهای موجود در برگ و گرهک، غلظت لگ هموگلوبین، سرعت تنفس در ریشه های دارای گرهک، غلظت اسیدهای آلی، فعالیت آنزیم-های مسیر آسکوربات-گلوتاتیون و کاتالاز و همچنین غلظت مولکول های آنتی اکسیدانت آسکوربات و گلوتاتیون اندازه-گیری شد. نتایج نشان داد که اعمال تنش خشکی توسط توقف آبیاری روزانه برای 2 و 3 روز باعث شد تا فعالیت ظاهری نیتروژناز (ana)، فعالیت کل نیتروژناز (tna) و سرعت تثبیت نیتروژن در گرهک های حاصل از همزیستی نخود با سویه های c-15، cp-31 و cp-36 به میزان معنی داری کاهش پیدا کند ولی میزان کاهش در فعالیت نیتروژناز و سرعت تثبیت نیتروژن بسته به سویه ریزوبیوم تلقیح شده متفاوت بود. کاهش در فعالیت نیتروژناز و سرعت تثبیت نیتروژن در طی 2 و 3 روز توقف آبیاری روزانه در گرهک های حاصل از همزیستی نخود با سویه c-15 در مقایسه با کاهش مشاهده شده در گیاه نخود تلقیح شده با سویه های cp-31 و cp-36 پایین تر بود. بیان ژ های کد کننده دی نیتروژناز (nifd و nifk) و دی نیتروژناز ردوکتاز (nifh) در گرهک های حاصل از همزیستی نخود با سویه های c-15، cp-31 و cp-36 کاهش نشان داد و با آبیاری مجدد، سطح کاهش یافته بیان این ژن ها در گرهک های حاصل از سویه c-15 به سطح شاهد برگشت پیدا کرد. کاهش فعالیت نیتروژناز و سرعت تثبیت نیتروژن تحت تنش خشکی به واسطه تغییر در قابلیت دسترسی سلول های آلوده گرهک به o2 و همچنین تغییر در ظرفیت تنفسی باکتروئید نبود. فاکتور محدود کننده دیگر فعالیت گرهک و آنزیم نیتروژناز تحت شرایط تنش خشکی می تواند یک کاهش در ظرفیت تنفسی باکتروئیدها باشد. اندازه گیری سرعت تنفس ریشه های دارای گرهک توسط تولید co2 نشان داد که با توقف آبیاری روزانه برای 2 و 3 روز سرعت تنفس در گیاهان نخود تلقیح شده با سویه های c-15، cp-31 و cp-36 به میزان معنی داری کاهش نشان داد ولی سطح کاهش در سرعت تنفس بسته به سویه ریزوبیوم تلقیح شده با گیاه نخود متفاوت بود. تخمین غلظت اسیدهای آلی (اسید مالیک، اسید سوکسینیک و اسید فوماریک) در درون گرهک های تحت تنش خشکی نشان داد که در شرایط تنش خشکی علیرغم قابلیت دسترسی باکتروئید به سوبستراهای تنفسی (اسید مالیک و اسید سوکسینیک)، باکتروئیدها به واسطه صدمه به سیستم تنفسی و متابولیسمی شان قادر به استفاده این سوبستراها نیستند. تجمع اسیدهای آلی در درون گرهک های حاصل از سویه های c-15،cp-31 و cp-36 تحت تنش خشکی پیشنهاد می کند که محدودیت سوبستراهای کربن دلیل کاهش فعالیت نیتروژناز تحت شرایط تنش خشکی در گرهک های نخود نیست. تنش خشکی فعالیت آنزیم های ساکاروز سنتتاز، آلکالین اینورتاز، فسفوانول پیروات کربوکسیلاز و مالات دهیدروژناز را در گرهک های حاصل از سویه های c-15، cp-31 و cp-36 تحت تاثیر قرار نداد. بنابراین این نتایج نشان می دهد که کاهش فعالیت نیتروژناز تحت تنش خشکی به واسطه ممانعت فعالیت آنزیم های متابولیسم کربن تحت تنش خشکی نیست. سطوح افزایش یافته ترکیبات نیتروژنی نظیر آمینواسیدها نقش مهمی در کاهش فعالیت نیتروژناز در پاسخ به شرایط کم آبی ایفا می کنند. نتایج این مطالعه نشان داد که غلظت آمینواسیدها در گرهک های حاصل از سه سویه مورد بررسی در پاسخ به تنش خشکی به میزان معنی داری افزایش پیدا کرد و بنابراین باعث بازدارندگی فعالیت آنزیم نیتروژناز توسط یک مکانیسم فیدبکی می شوند. مکانیسم دیگری که در بازدارندگی فرایند تثبیت نیتروژن تحت تنش خشکی نقش بازی می کند تنش اکسیداتیو است. در گرهک های حاصل از همزیستی مقاوم به خشکی نخود با سویه c-15، فعالیت آنزیم های آسکوربات پراکسیداز، مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز و کاتالاز در گرهک های تحت تنش خشکی به میزان معنی دار افزایش پیدا کرد. در گرهک-های حاصل از همزیستی حساس به خشکی نخود با سویه های cp-31 و cp-36، فعالیت آسکوربات پراکسیداز تحت 2 و 3 توقف آبیاری به میزان قابل ملاحظه ای کاهش نشان داد و بعد از آبیاری مجدد گیاهان سطح کاهش یافته این آنزیم جبران نشد. در گرهک های حاصل از سویه c-15، محتوی آسکوربات (asc) و گلوتاتیون احیاء شده (gsh) تحت شرایط تنش خشکی افزایش معنی داری پیدا کرد ولی در گرهک های حاصل از سویه های cp-31 و cp-36، محتوی asc و gsh در گرهک های تحت تنش خشکی کاهش پیدا کرد. نتایج این مطالعه نشان داد که محدودیت در ظرفیت متابولیکی باکتروئید، تجمع آمینواسیدها به ویژه آسپاراژین در درون گرهک و نه برگ ها و صدمات اکسیداتیوی اجزاء سلولی عوامل شرکت کننده در ممانعت فعالیت آنزیم نیتروژناز در گرهک های نخود در مراحل اولیه تنش خشکی هستند.