تولید آنتی بادی پایدار شده بر عتیه ترکیبات پیریدینیوم کراس لینک استخوان جهت اهداف تشخیصی

استخوان یکی ازبافتهای پیوندی اصلی است که در ساختار آن کلاژن وجود دارد.کلاژن نوع بیش از 90 درصد ماتریکس استخوان را تشکیل می دهد. ایجاد اتصالات عرضی بین کلاژن به صورت pyridinium cross link در ناحیه تلوپپتید غیر هلیکال از یک زنجیره،با ناحیه هلیکال از زنجیر کناری،منجر به استحکام استخوان در طول بلوغ کلاژن می شود.ترکیبات پیریدینیوم کراس لینک،با تجزیه شدن استخوان،وارد گردش خون شده و بدون تغییرات در ادرر ترشح می شود.میزان این ترکیبات، برای افرادی با سن و جنس مشخص،یک حد معینی دارد.در بیماری های متابولیکی استخوان،مثل بیماری پوکی استخوان،استخوان به صورت غیر نرمال شروع به تجزیه شدن میکندو بنابر این،میزان ترکیبات پیریدینیوم کراس لینک ، بیش از حد معمول در ادرار ترشح می شود.بنابر این استفاده کلینیکی از این قطعات،برای تشخیص این بیماری قابل انجام می باشد.در بیماری پوکی استخوان که به آن بیماری خاموش نیز گفته می شود،استخوانها بدون هیچ تظاهر بالینی ، شروع به تجزیه می کنند و هنگامی که علائم آن به صورت تظاهرات بالینی یعنی درد و یا شکستگی بروز می کند،بیماری در مرحله پیشرفته است. پوکی استخوان درزنان به علت تغییرات هورمونی ، بخصوص در زمان بعد از یائسگی چهاربرابر مردان است.در کشور ما متوسط تراکم استخون در افراد سالمدر مقایسهبا کشور هایی مثل ژاپن، 9/3 درصد بالاتر ،و نسبت به آمریکا ،6/4 درصد کمتر است.این در حالی است که در کشور آمریکا ،55 درصد آنها در معرض پوکی استخوان قرار دارند.طبق آمار وزارت بهداشت،47 درصد زنان و 44 درصد مردان بالای 50 سال در ایران دچارکاهش تراکم استخوان هستند.بر طبق آمار در ایران در طول یک سال،شاهد ازدست رفتن 36761 سال از عمر کل جامعه به علت بیماری پوکی استخوان هستیم.تخمین زده می شود.در آمریکا سالانه فقط 10 بیلیون دلار، هزینه این بیماری میشود.در حال حاضر برای تشخیص این بیماری از سنجش تراکم استخوان (دانسیتو متری )استفاده می شود. سنجش تراکم استخوانی bmd ،برای یک سری افراد خاصی مثل زنان بالای 65 سال و زنان یائسه زیر 65 سال، در صورت داشتن سابقه شکستگی، درمان طولانی با کورتیکوئیدها، مردان 70 ساله و بالاتر انجام می گیرد و به علت هزینه های بالا ،در افراد عادی یا افراد مورد شک ، نمی تواند قابل اجرا باشد.از طرفی، اختلالات ساختاری استخوان ،(استنوارتریت شدید) تفسیر نتایج را مخدوش می کند. و نیز معمولاً در کنار این روش، تشخیص کمکی نیز مثل درخواست آزمایش cbc- esr- fbs- na- k- ca--ast-alt -tshآلکالین فسفاتاز و ... نیز انجام می گیرد که این روش خود زمان بر و هزینه بر می باشد. در مورد رادیوگرافی ساده، باید گفت که پرتونگاری x-ray تا زمانیکه تراکم استخوان بیش از30 % کاهش نیافته باشد، مشاهده نمی شود و به ظاهر دانسیته نرمال را نشان می دهد. از طرفی تفسیر تصاویر تا حدی وابسته به قضاوت رادیولوژیست است و نباید مبنای شروع درمان قرار گیرد. بنابراین وجود یک روشی که اولا در تمام موارد سنی و تمام افراد قابل اجرا باشد، به راحتی تست گیری انجام شود و برای بیمار مشکل ایجاد درد یا ناراحتی به وجود نیاید، نیازی به آزمایشات جانبی وجود نداشته باشدو مهم تر اینکه هزینه کم تر برای بیماران داشته و در مدت زمان کم تری نتیجه آزمایش معین شود،ضروری است. لازم به ذکر است که در سالهای اخیر از میزانpro ادرار برای تعیین پوکی استخوان استفاده می شد، ولی با توجه به اینکهpro در کبد متابولیز می شود و تحت تاثیر رژیم غذایی می باشد، پس مارکر دقیق در تعیین پوکی استخوان نیست. همان طوری که قبلا شرح داده شد، ترکیبات پیریدنیوم کراس لینک که در زمان تجزیه استخوان وارد ادرار می شوند، یک میزان مشخصی در افراد سالم با سنین معلوم دارند، بررسی تغییرات مارکر مربوطه در ادرار توسط متد الایزا ،می تواند: - به خوبی نماینده تجزیه استخوان بوده و به این ترتیب ما را قادر سازد تا بیماری را در مراحل بسیار اولیه و در افراد مختلف با هزینه بسیار اندک ، دقت بسیار بالاوزمان بسیار کوتاه شناسایی کنیم. در این تحقیق بعد از خالص و جدا کردن ترکیبات پریدیم کراس لینک از استخوان به روش hplc ترکیب آنتی ژن توسط ادجوانت مناسب به خرگوش در دفعات متعدد تزریق و پس از دو ماه خون گیری انجام شد پس از جدا شدن نمونه خونی و رسوب پروتین میزان تیتر اولیه ab1/3000 به دست آمد ،که این تیتر بالا نشان دهنده میزان تولید خوب و کافی ab بوده است. پس از جدا کردن ab با روش deae سفارز اقدام به سنجش میزان آنتی ژن به روش الایزای sandwich نمودیم. رسم منحنی استادارد به روش الایزا جهت تعیین میزان آنتی ژن مجهول انجام گرفت از آنجایی که هدف اصلی ما تولید کیت پایدار شده برای تشخیص مارکر مربوطه بود، در مرحله بعدی، تثبیت توسط بستر آمین و نیز نانوذرات طلا انجام گرفت. بستر حاوی عوامل دی آمین بوده و به خوبی با آنتی بادی واکنش می دهد. استفاده از سوربیتول جهت پایدار سازی ab موجب پایدار شدن بیشتر آن در دمای آزمایشگاه، حتی بعد از سپری شدن زمان بیست روز می باشد. در روش دیگر با استفاده از بستر آمینی و نانوذرات طلای متصل شده به آن ab، اکسید شده که بیشترین توانایی و استحکام را در اتصال به نانوذرات طلا دارد، متصل شد. پس از استفاده از سوربیتول ،تحت آزمون الایزا قرار گرفت. کیت مربوطه در دمای آزمایشگاه تا یک ماه پایدار بود. از آنجایی که هدف اصلی ما از تولید کیت ، عرضه آن در سطح تولید تجاری می باشد ،کیت پایدار در دمای آزمایشگاه توانایی ذخیره سازی به مدت چندین سال در دمای4? را دارد. و این مزیت جهت استفاده کلینیکی از آن بسیار مهم و مفید می باشد