امکان سنجی شمارش کروموزوم های x و y (تعیین نسبت جنسی) در اسپرم گاو با استفاده از فناوری real-time pcr

در این مطالعه به منظور امکان سنجی تعیین جنسیت اسپرم گاو توسط تکنیک real-time pcr،تعداد کپی ژنsry که مسئول تولید صفات ثانویه جنسی درجنس نر و بر روی کروموزوم yقراردارد به عنوان شاخص برای شمارش تعداد کروموزوم yدر اسپرم وتعداد کپی ژن plp که مسئول تولید پروتئولیپید پروتئین و بر روی کروموزوم x می باشد، به عنوان شاخص برای شمارش تعداد کروموزوم x در اسپرم در نظر گرفته شدند. بدین منظور استخراج dnaبا یک روش اختصاصی از45نمونه اسپرم گاو انجام گرفت.به منظور تکثیر دوژن sryوplpدر سطح dna دوجفت پرایمر اختصاصی برای این دو ژن طراحی و بخوبی تکثیر را در سیستم pcrنشان دادند.به منظور مطالعه کمی و ساختن نمونه استاندارد و نهایتا ترسیم منحنی استاندارد ، محصولات pcr حاصل از تکثیر این دو ژن به روش t/a cloning در وکتور ptz57r/t کلون شدند. برای تایید اولیه کلونینگ، از تکنیک joint pcr استفاده شد ، برای تایید نهایی همسانه سازی، نمونه ها تعیین توالی شدند. سپس از هر پلاسمید نوترکیب پنج رقت ng/µl (106،105،104،103، 102 ) ساخته شدند.این رقت ها در واکنش real-time pcr هریک دارای یک ctمشخص بودند و بدین ترتیب منحنی استاندارد حاصل از این رقت ها و ctمرتبط با هر رقت و معادله خط مربوط به آن بدست آمد که با قرار دادن ctنمونه آزمایشی در این معادله تعداد کپی هریک از ژن های sryو plp که به ترتیب نمایانگر تعدادکروموزوم xوyمی باشند،محاسبه شدند. به منظور ارزیابی و اعتبار سنجی دقت روش، پارامترهای repeatability، reproducibility و accuracy محاسبه شدند. dnaاستخراج شده از نمونه های اسپرم مورد آزمایش قرار گرفتند که نتایج بدست آمده با دقت بالا و نزدیک به نتایج مورد انتظار بودند (1:1) میانگین تعداد کروموزوم شمارش شده برای غلظت های متفاوت dna موجود در واکنش های repeatability، که در دومرحله انجام شده بودند نیز تفاوت معنی داری نداشتند.نتایج حاصل از 10 تکرار از یک نمونه اسپرم در هر رقت با 2 تکرار برای شمارش کروموزوم x به منظور ارزیابی آزمون reproducibility مربوط به این روش مورد بررسی قرار گرفتند. میانگین تعداد کروموزوم برای غلظت های متفاوت dna موجود در این مرحله به لحاظ آماری وبا در نظر گرفتن احتمال خطای 5درصد تفاوت معنی داری داشتند.به منظور تایید عملکرد صحیح این روش ،آزمون accuracy نیز صورت پذیرفت بدین صورت که از 5 نمونه خون حاصل از 5 گاو نر استخراج dna به عمل آمد واز هرنمونه 4 رقت ساخته شد تا نتایج مورد انتظار یعنی 50% سلول های حاوی کروموزوم x باشند مورد بررسی قرار گیرد. از همین نمونه ها و رقت ها برای شمارش کروموزوم های y نیز استفاده شد. ضریب تغییرات رقت های مختلف مشابه بودند..نتایج بدست آمده در این مطالعه به خوبی نشان میدهد که روش real-time pcr قابلیت شمارش کروموزوم های جنسی و تعیین نسبت جنسی را در اسپرم دارامی باشد.در طی انجام این پروژه،توالی یابی ژن ها ی sryو plpنیزانجام گرفت که توالی ها با شماره دستیابی hq908797 برای ژن sryو با شماره دستیابی hq875721 برای ژن plpدر بانک اطلاعاتی ncbiثبت شدند.