انتقال توام ژن های کیتیناز (chit42) و گلوکاناز (bgn13.1) قارچ trichoderma به سیب زمینی

سیب زمینی (solanum tuberosum l.) یکی از گیاهان زارعی مهم جهان می باشد که به عوامل بیماری-زای قـارچی از جمله rhizoctonia solani (ag-3) عامل بیماری رایزوکتـونیایی حساس می باشد. قارچ های بیماری زا یکی از مهم ترین عوامل ایجاد خسارت به محصولات زارعی می باشند. یکی از روش های کنترل بیماری های قارچی، استفاده از مهندسی ژنتیک برای انتقال ژن های رمزکننده آنـزیم های تخریب کننده دیواره سلولی قارچ ها، خصوصاً کیتینازها و گلوکانازها به گیاهان زراعی می باشد. قارچ-های آنتاگونیست مانند تریکودرما، با تولید آنزیم های هیدرولازی قدرتمند کیتیناز و گلوکاناز، اثر بازدارنده قابل توجهی بر رشد قارچ های بیماری زا دارند و در غلظت های بالا برای گیاه غیر سمی بوده و اثر مخربی بر رشد و نمو گیاهان تراریخته ندارند. آنزیم های جدا شده از گونه های مختلف این قارچ در مقایسه با آنزیم های جدا شده از منابع دیگر مثل آنزیم های گیاهی، فعالیت ضد قارچی بیشتری داشته و بر طیف وسیع تری از گونه های بیماری زا عمل می کنند. در عین حال به کار بردن هم زمان آنزیم های تخریب گر دیواره سلولی قارچ، اثر هم افزایی در مبارزه با قارچ های بیماری زا دارد. در این تحقیق، از ژن کیتیناز chit42 جدا شده از قارچ های trichoderma atroviride و ژن گلوکاناز bgn13.1 جدا شده از قارچ t. virens، جهت ساخت سازه های بیانی گیاهی شامل دو سازه تک ژنی واجد ژن chit42 (pbike1) و واجد ژن bgn13.1 (pbike2) و یک سازه واجد هر دو ژن (pbike3) استفاده شد. در این سـازه هـا، هر یـک از ژن های یاد شده، تحت کنترل پیشبر camv 35s و خاتمه دهنده نوپالین سینتاز (nos) قرار گرفتند. همچنین ناقلی با نام pbi121gus- مبتنی بر ناقل pbi121 طراحی و ساخته شد که فاقد ژن gus بوده و ضمن داشتن کاست کامل بیانی ژن مقاومت به کانامایسین، دارای دو جایگاه آنزیم های برشی xbai و bamhi برای همسانه سازی ژن های مورد نظر بین پیشبر camv 35s و خاتمه دهنـده nos مـی باشد. برای انتقال سازه های مـورد نظر به گیاه سیب زمینی، ریز غده پنج رقم مهم سیب زمینی در ایران (ساوالان، آگریا، مارفونه، ساتینا و بورن) تولید شده و سازه های واجد ژن های کیتیناز و گلوکاناز با استفاده از سویه lba4404 باکتری agrobacterium tumefaciens به برش های ریز غده (به عنوان جداکشت) منتقل شدند. حضور ژن های مورد نظر در گیاهان تراریخته و بیان آنها در سطح رونویسی به ترتیب توسط pcr و rt-pcr تایید گردید. همچنین با استفاده از روش های زیست سنجی مختلف، مشخص شد پروتئین های حاصل از بیـان ژن های منتقل شده به گیاهان تراریخته، فعالیت ضد قارچی قابل ملاحظه ای برابر r. solani (ag-3) دارند. از آنجا که در این تحقیق ناقل pbi121 که ژن مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین بر روی آن قرار دارد، جهت انتقال ژن مورد استفاده قرار گرفت، برای یافتن بهترین غلظت آنتی بیوتیک کانامایسین، رشد و مقاومت گیاهچه های سیب زمینی پنج رقم سیب زمینی مورد استفاده در غلظت های مختلف آنتی بیوتیک گزینشگر کانامایسین نیز مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاکی از رشد گیاهچه های غیر تراریخت سیب زمینی تا غلظت 100 میلی گرم در لیتر کانامایسین بود گرچه نشانه هایی از قبیل عدم گسترش مناسب اندام های هوایی، کوتاهی و نازکتر شدن ساقه گیاهچه ها، رنگ پریدگی و کاهش تعداد و ریز شدن برگ ها مشاهده گردید. بر اساس نتایج به دست آمده، ارقام ساوالان و مارفونه حساسیت بیشتری نسبت به کانامایسین داشته و رقم ساتینا مقاوم ترین رقم سیب زمینی نسبت به کانامایسین در بین ارقام مورد بررسی این پروژه می-باشد. همچنین cdna ژن های chit42 و bgn13.1 به طور جداگانه در ناقل بیانی pet-26b(+) تحت کنترل پیشبر باکتریوفاژ t7 و در پایین دست توالی راهنمای pelb همسانه سازی شدند. پس از انتقال سازه های بیانی پروکاریوتی به سویه bl21(de3) plyss باکتری escherichia coli مشخص شد که پروتئین نوترکیب chit42 در میزبان پروکاریوتی بیان شده و پس از انتقال به فضای پریپلاسمی، به محیط کشت ترشح می گردد. نتایج آزمون های مختلف نشان داد که این پروتئین نوترکیب قادر به تجزیه کیتین بوده و اثر بازدارنـده آن نیز بر رشد قـارچ r. solani (ag-3) در شرایط in vitro تایید گردید.