تولید فرآورده بیولوژیک کیتیناز از میکروارگانیسسم های موجود در پ116ساب مزارع پرورش میگو

از جمله اهداف این پروژه می توان به جداسازی میکروارگانیسم های بومی تولید کننده کیتیناز، انتخاب مناسب ترین سویه، استحصال فرآورده بیولوژیک کیتیناز و بهینه سازی تولید آنزیم با استفاده از طراحی آزمایشات تاگوچی اشاره نمود. در این تحقیق از آب و پساب مزارع پرورش میگو در جنوب ایران سه سویه مزوفیل شامل ,serratia marcescens, citrobacter freundii و bacillus cereus و یک سویه ترموفیل bacillus thermodenitrificans با توانایی تولید آنزیم های تجزیه کننده کیتین جداسازی و شناسایی گردید که در بین آنها سویه serratia marcescens به دلیل بیشترین میزان تولید کیتیناز در محیط کشت مایع، برای مطالعات بیشتر انتخاب گردید. همچنین این سویه بومی ایران بوده و با شرایط اقلیمی و بومی ایران، به خصوص جنوب کشور سازش پذیر است و بدون دستکاری ژنتیکی و به طور طبیعی به میزان قابل توجهی آنزیم کیتیناز تولید می کند. بر همین اساس بهینه سازی محیط کشت به منظور تولید حداکثر کیتیناز توسط این گونه با کمک طراحی آزمایشات تاگوچی صورت گرفت و با استفاده از نرم افزار qualitek 4 مناسب ترین سطوح پارامترهای فیزیکی و ترکیب محیط کشت شامل درجه حرارت، ph ، % nacl ، %‍chitin به ترتیب c? 30 ، 9/7 ، 1/0 % و 1 % به دست آمد. این پروژه کارایی استفاده از طراحی آزمایشات تاگوچی برای تشخیص ترکیبات مناسب محیط کشت و میزان آنها به منظور دستیابی به حداکثر آنزیم کیتیناز را ثابت نمود و همچنین تایید کرد که استفاده از طراحی تاگوچی، با توجه به صرفه جویی در هزینه و زمان نسبت به روشهای سنتی به طور واضحی اقتصادی تر است. تهیه پودر کیتین از پوسته های میگو و استفاده از آن در این تحقیق، مشخص نمود که می توان از پوسته های میگو که به عنوان ضایعات دور ریخته می شوند، در تهیه فرآورده های مفید استفاده نمود که علاوه بر پاکسازی محیط زیست، می تواند منافع اقتصادی نیز در بر داشته باشد. مطالعه بر روی 8 منبع آلی و معدنی نیتروژن و 11 منبع کربن مشخص نمود که عصاره مالت و کیتین کلوییدی به ترتیب مناسب ترین منابع نیتروژن و کربن برای تولید حداکثر کیتیناز توسط سویه serratia marcescens می باشد. یونیت و غلظت پروتئین آنزیم کیتیناز تولید شده در این پروژه به ترتیب 415/0 میکرومول و 92/0 میلی گرم در میلی لیتر به دست آمد. انجام sds_page و الکتروفورز dna بر روی ژل آگارز 1% نشان داد که وزن مولکولی آنزیم و وزن مولکولی ژن کیتیناز تولید شده به ترتیب 54 کیلو دالتون و bp1600 می باشد. حداکثر فعالت آنزیم در ph 5 و درجه حرارت c? 45 به دست آمد. آنزیم درc? 55 به مدت 20 دقیقه و در محدوده ph 9 -3 به مدت 90 دقیقه پایدار بود. kmو vmax به ترتیب 3/8 میلی گرم در میلی لیتر و 4/2 میلی مول در دقیقه به دست آمد. میزان فعالیت آنزیم در حضور ترکیبات شیمیایی متفاوت و یونهای فلزی مورد بررسی قرار گرفت و مشخص گردید کیتیناز استخراج شده در برابر اکثر مواد فعال کننده سطحی و یونهای فلزی از خود مقاومت نشان می دهد. همچنین یدواستامید و یدواستیک اسید فعالیت آنزیم را مهار نکرد که نشان دهنده عدم وجود اسید آمینه سیستئین در جایگاه فعال انزیم می باشد و دترجنت های فعال سطحی مانند sds و تووین 20 و 80 ، فعالیت آنزیم کیتیناز را هر کدام به ترتیب به میزان2%، 23% و 20% تحریک می کنند این نتیجه شاید ناشی از این مساله باشد که این مواد فرکانس اتصال بین جایگاه فعال آنزیم و سوبسترا را با کاهش کشش سطحی محیط آبی، افزایش می دهند. تاثیر کیتیناز تولید شده در این پروژه بر روی کیتین به کمک میکروسکوپ الکترونی مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که آنزیم با ایجاد شکاف و حفرات پیش رونده کیتین را تجزیه می نماید. کیتیناز تولید شده از سویه بومی در این پروژه خواص ضد قارچی بر روی آفات بیماریزای گیاهان شامل rizoctonia solani, bipolaris sp., alternaria raphani alternaria brassicicola از خود نشان داد و مشخص نمود که آنزیم فوق پتانسیل بررسی بیشتر به منظور تولید آفت کش های بیولوژیک را دارا می باشد.