بررسی توانایی تحویل و بیان ژن gfp توسط نانوزیست-ذرات مشتق از فاژ لامبدا در سلولهای یوکاریوتی

چکیده ژن درمانی یکی از پرآوازه ترین رشته های تحقیقاتی دانش پزشکی است که نویدبخش درمان برخی بیماریهایژنتیکی و سرطان است. با اینحال این رشته با مشکلات زیادی از جمله فقدان حاملهای ژنی کاملا بی خطر برای استفاده در بالین مواجه است. چون فاژها تمایلی به سلولهای پستانداران ندارند لذا حاملهای بی خطر و جذابی به حساب می آیند. در این پژوهش برای دست یابی به یک حامل ژنی مبتنی بر فاژ لامبدا، توالی کدکننده پروتئین gfp با استفاده از پلاسمید pegfp-n1 به عنوان الگو توسط pcr تکثیر و در ناقل فاژی lambda zap®-cmv xr تحت کنترل پروموتر cmv وارد گردید. سازه حاصل با استفاده از عصاره بسته بندی gigapack iii gold packaging به صورت برون سلولی بسته بندی و ذرات فاژی نوترکیب ?-gfpتولید شدند. آلوده سازی سلولهای رده ags انسانی با ذرات فاژی حاصل نشان داد که ذرات فاژی می توانند به سلولها وارد و با کارآیی کمی (حدود 0.02%) باعث بیان ژن gfp شوند. با اینحال، علارغم کارآیی پایین بیان، تکثیر توالی ترانس ژن توسط pcr با استفاده از dna تام استخراج شده از سلولهای تیمار شده با ذرات فاژی ?-gfp نشان داد که کارآیی ورود به سلولها نسبتا قابل توجه است. برای افزایش کارآیی ورود و بیان ژن، ذرات فاژی?-gfp با اتصال شیمیایی ملکولهای ترانسفرین به سطح آنها هدفگیری شده، بدین ترتیب نانوحامل ژنی هدفمند (tf-targeted ?-gfp) بدست آمد. اتصال ملکولهای ترانسفرین به سطح ذرات فاژی با الیزا بررسی و فعال بودن آنها با انجام cell-elisa نشان داده شد. بررسیهای کمی نشان داد که به طور میانگین 1123 ملکول ترانسفرین به هر ذره فاژی اتصال یافته است. این یک یافته منحصر بفرد است زیرا با استفاده از روش معمول فاژنمایی(phage display) تنها امکان نمایش 420 نسخه در بهترین حالت وجود خواهد داشت. در ادامه توانایی ورود نانوحامل ژنی هدفمند به سلولهای 293t با تکنیک ایمنوسیتوشیمی بررسی شد و نشان داد که ذرات هدفمند با کارآیی بسیار بالاتری نسبت به ذرات غیرهدفمند (ذرات فاژی اتصال نیافته با ترانسفرین) می توانند به سلولهای رده 293t انسانی وارد شوند. همچنین توانایی انتقال و بیان ژن توسط نانوحامل ژنی هدفمند به سلول های 293t با استفاده از تکنیک facs بررسی شد. نتایج حاصل از facs نشان داد که کارآیی انتقال و بیان ژن توسط نانوحامل در اثر اتصال و هدفگیری با ترانسفرین از 61/0% (توسط ذرات غیرهدفمند) به 7/6% (توسط نانوحامل ژنی هدفمند) افزایش یافته است. روی هم رفته این نتایج نشان می دهند که راهکار استفاده از اتصال شیمیایی ملکول-های هدف گیری به سطح ذرات فاژی به عنوان یک راهکار نوین می تواند به نمایش تعداد بیشتری از ملکول هدف گیری در سطح فاژ بیانجامد که به نوبه خود می تواند باعث بهبود کارآیی انتقال ژن بکمک فاژ به سلول های پستانداران شود.