ردیابی پوتی ویروس ها در مزارع استان آذربایجان شرقی

خانواده های کدوئیان، سولاناسه، کلمیان، حبوبات و غیره که در گروه سبزیجات طبقه بندی می شوند، با اهمیت اقتصادی فراوان به طور وسیع در شمال غرب کشور کشت می شوند. این گیاهان مورد حمله ی ویروس های زیادی قرار می گیرند که پوتی ویروس ها از مهم ترین ویروس های آلوده کننده ی این گیاهان می باشند. جنس پوتی ویروس متعلق به خانواده پوتی ویریده و دارای 111 گونه ی مشخص و 86 گونه ی موقتی است. این ویروس ها دارای ژنوم یک بخشی به طول تقریبی 10000 جفت باز می باشد. پوتی ویروس ها با پراکنش جهانی، وسیع ترین دامنه ی میزبانی را در سطح جنس و در بین ویروس های گیاهی داشته که در مزارع ایران نیز شیوع دارد و باعث کاهش راندمان محصول و خسارت جبران ناپذیر به مزارع می شود. از آنجایی که ردیابی پوتی ویروس ها و بررسی تغییرات ژنتیکی در بین جدایه های آنها گامی موثر در جهت کنترل این ویروس ها می باشد، هدف از این تحقیق، استفاده از روش های مولکولی مناسب و بهینه در ردیابی پوتی ویروس ها و تعیین گونه ها ی آنها می باشد. در تحقیق حاضر به منظور ردیابی این ویروس ها از مزارع مختلف آذربایجان شرقی و اردبیل طی بهار ، تابستان و پاییز سال 1389تعداد 215 نمونه گیاهی مشکوک به آلودگی با پوتی ویروس ها نمونه برداری شدند. علایم شامل موزاییک، ابلقی، بدشکلی برگ و میوه، تاولهای سبز رنگ روی برگ ومیوه و نقش ونگار های حلقوی شکل روی میوه ها بودند. در مطالعات گلخانه ای از گیاهان سلمه تره(chenopodium amaranticolor)، کدو(cucurbita pepo)، لوبیا(phaseolus vulgaris) و توتون(nicothiana tabacum cv.samsun) به عنوان میزبان های تشخیصی و از کدو، لوبیا و توتون به عنوان میزبان تکثیری استفاده شد. با انجام آزمون آرتی-پی سی آر با 2 جفت آغازگر عمومی، از 61 نمونه ی مورد بررسی، 7 نمونه به جفت آغازگر sprimer/m4 و 29 نمونه نیز به جفت آغازگر nib2f/nib3r پاسخ مثبت دادند. جفت آغازگر sprimer/m4 که منطبق بر ژن رمز کننده ی nib/polya می باشد، قطعه ای به طول 1600-2100 جفت باز را تکثیر دادند. همچنین جفت اغازگر nib2f/nib3r، قطعه ای به طول 350 جفت بازی را تکثیر دادند. قطعات دی ان ای 350 جفت بازی حاصل از جفت آغازگر nib2f/nib3r به پلاسمید ptz57r/t متصل و در باکتری e.coli dh5? کلون شدند. باکتری های ترنسفرم شده با پلاسمید نوترکیب بر روی محیط کشت lb حاوی آمپی سیلین، iptg، x-gal ، غربال شده و پلاسمید از آنها به روش لیز آلکالینی استخراج گردید. پلاسمید های استخراج شده با آنزیم های برشی ecor?/hind??? با محل اثر در 2 طرف محل اتصال دی ان ای خارجی برش داده شدند. به منظور شناسایی گونه ها ی جنس پوتی ویروس و مقایسه ی توالی نوکلئوتیدی بخش تکثیر یافته از ژن nib جدایه ها و مقایسه با سایر جدایه های این جنس ، تعیین توالی نوکلئوتیدی انجام گرفت. از بین 5 جدایه ی مورد بررسی، 4 جدایه به عنوان گونه های جنس پوتی ویروس شناخته شد. هر 4 توالی نوکلئوتیدی به اندازه ی 302 نوکلئوتید (پس از حذف توالی اغازگر ها) به پایگاه اطلاعاتی genbank واگذار گردید. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی هر یک از این جدایه ها با توالی های بدست آمده از بلاست در سایت ncbi انجام گرفت. جدایه ی a187 به عنوان گونه ی ویروس وای سیب زمینی شناخته شد و در درخت فیلوژنی موقعیت این جدایه در بین سایر جدایه ها متمایز است. جدایه ی t205 به عنوان ویروس موزاییک هندوانه شناخته شده و بیش ترین تشابه را با جدایه های ایرانی نشان داد. جدایه ی t172 نیز به عنوان گونه ی ویروس موزاییک معمولی لوبیا شناخته شد و با جدایه هایی از فنلاند، هلند در یک خوشه قرار دارد. همچنین جدایه ی t67 به عنوان گونه ی ویروس موزاییک زرد لوبیا شناسایی شد و با جدایه ای از استرالیا در یک خوشه قرار می گیرد.