تولید ساختار دستکاری شده آنزیم epsps باکتری e.coli

آنزیم کلیدی 5-انول پیروویل شیکیمات 3-فسفات سینتاز (epsps) مرحله ششم مسیر شیکیمات را که برای سنتز اسیدهای آمینه و ترکیبات حلقوی در جلبک ها، قارچ ها، باکتری ها و گیاهان پیشرفته ضروری است کاتالیز می کند. این آنزیم محل اثر علف کش عمومی گلایفوسیت می باشد که عمل بازدارندگی خود را از طریق رقابت با فسفو انول پیرووات (pep) در محل اتصال آن با این آنزیم اعمال می کند. اسیدهای آمینه متفاوتی در این آنزیم تغییر داده شده اند که هر کدام سطوح مقاومت مختلفی را نسبت به گلایفوسیت نشان داده اند. یکی از اسیدهای آمینه ای که مورد مطالعه قرار گرفته اند گلایسین 96 می باشد که در جایگاه اتصال pep به آنزیم قرار دارد. در این مطالعه برای جایگزینی gly96 با اسید آمینه های آلانین (a) و والین (v) با استفاده از dna ژنومی باکتری e.coli ژن مربوط به این آنزیم را با واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr) با پرایمر های اختصاصی دارای جایگاه برش xba1 و sma1 تکثیر و در وکتور کلونینگ ptz57r/t همسانه سازی شد. برای ایجاد جهش های مورد نظردر ژن epsps از باکتری e.coli سویه k12 از روش site directed mutagenesis (sdm) استفاده گردید. در این روش ابتدا با استفاده از پرایمر موتانت و یکی از پرایمرهای اختصاصی ژن (p1)، مگا پرایمر ایجاد و در مرحله بعد از مگاپرایمر به عنوان پرایمر اختصاصی ژن استفاده و همراه با پرایمر اختصاصی دوم (p2)، ژن جهش یافته با طول کامل تکثیر شد. ژنهای جهش یافته در داخل وکتور ptz5r/t همسانه سازی شد . پس از تعیین توالی ژن های تیپ وحشی و جهش یافته برای تراریزش گیاه برنج در داخل پلاسمید بیانی ppzpy122 همسانه سازی گردید.