خالص سازی و تعیین خواص بیوشیمیایی یک آنزیم آمیلولیتیک از باکتری های فوق گرمادوست (hyperthermophile) جدا شده از چشمه آب گرم قینرجه

آنزیم های آمیلولیتیک از مهمترین آنزیم ها در صنعت و بیوتکنولوژی بشمار می آیند و امروزه جداسازی این آنزیم ها از میکروارگانیسم های ترموفیل بسیار مورد توجه قرار گرفته است. در این تحقیق دو سویه ترموسی (gh11) و ژئوباسیلوسی (gh6) تولید کننده آنزیم های آمیلولیتیک مورد شناسایی قرار گرفته اند. تست های میکروبی متعدد، مطالعه اسیدهای چرب غشا و آنالیز 16s rdna برای این سویه های ترموفیلی انجام گرفت. تطبیق توالی جزیی 16s rdna سویه ترموسی gh11 با توالی سایر گونه های ترموسی، همولوژی بالای gh11 را با thermus brockianus نشان داد اما تفاوتهای بارز در سایر ویژگیها بویژه دمای رشد معرف گونه جدید ترموسی می باشد. سویه gh6 نیز تفاوتهایی با سایر گونه های ژئوباسیلوسی نشان می دهد. مالتوژنیک آمیلاز یکی از اعضای خانواده آلفا-آمیلاز می باشد که برخلاف سایر آلفا-آمیلازها داخل سلولی است و همچنین فعالیت هیدرولیزی و ترانس گلیکوزیلاسیون را از خود نشان می دهد. ?-سیکلودکسترین سوبسترای ترجیحی آن نسبت به پلولان و نشاسته می باشد. این خصوصیات مالتوژنیک آمیلاز به منظور تهیه اولیگوساکاریدهای شاخه دار و کربوهیدراتهای جدید مناسب است و آن را از سایر آنزیم های معمول خانواده آلفا-آمیلاز متمایز می کند. تاکنون تعداد معدودی مالتوژنیک آمیلاز از سویه های ترموفیلی جداسازی شده است و هیچ گزارشی مبنی بر جداسازی از سویه های ژئوباسیلوسی در دسترس نمی باشد. ژن کدکننده مالتوژنیک آمیلاز از سویه gh6 با استفاده از پرایمرهای طراحی شده تکثیر و در میزبان پروکاریوتی e. coli کلون و سپس تعیین توالی گردید. پلی پپتید متشکل از 1176 باقیمانده آمینواسیدی می باشد و همولوژی بالایی با توالی های مربوطه از سایر گونه ها بویژه thermus sp. im6501 نشان می دهد. به منظور بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم مالتوژنیک آمیلاز، پس از سونیکاسیون و تخلیص جزئی آنزیم از عصاره سلولی، فعالیت آن بر روی سوبستراهای مختلف و اثر دما و phهای مختلف روی فعالیت آمیلولیتیکی و پایداری آنزیم بررسی شد. با توجه به نتایج، مالتوژنیک آمیلاز فعالیت بهینه و حداکثر را به ترتیب در دمای ?c 65 و ?c 70 نشان می دهد، که از فعالیت بهینه مالتوژنیک آمیلازهای جداشده از bacillus subtilis (?c 45)، b. licheniformis (?c 50)، b. stearothermophilus(?c 55) و thermus sp. im6501 (?c 60) بالاتر می باشد. به علاوه پایداری حرارتی این آنزیم نسبت به همتاهای خود که تاکنون گزارش شده اند بطور محسوسی بالاتر بود. مدل ساختار سه بعدی آنزیم با استفاده از برنامه 9v2 modeller و بر اساس ساختار کریستالی thermus sp. im6501 ساخته شد. آنالیز ساختار سوم این آنزیم ها مشخص نمود که تعداد پیوندهای هیدروژنی و سطح در دسترس آنها تفاوت چندانی نشان نمی دهد، اما تعداد پل های نمکی در مدل ارائه شده مالتوژنیک آمیلاز سویه gh6 نسبت به سویه im6501 (الگو) بیشتر می باشد که این می تواند یکی از دلایل پایداری حرارتی و دمای بهینه بالاتر آن باشد.