بررسی پلی مورفیسم ژنتیکی بین ارقام شاخص گلرنگ ایران و دو رقم شاخص خارجی با استفاده از نشانگر rapd

مواد و روشها در این آزمایش از 18 نمونه داخلی و دو نمونه خارجی گلرنگ استفاده شده است. نمونه ها از مرکز تحقیقات کشاورزی مشهد و چند نمونه نیز از عطاریهای نقاط مختلف کشور جمع آوری شدند . از هر نمونه چند بذر داخل گلدان کشت شدند. نمونه های تازه گیاهی 15-10 روز بعد از جوانه زنی جمع-آوری شدند و به منظور استخراج به روش ctab برای بررسی کیفیت dna از ژل الکتروفورز و دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد که در این روش نمونه هایی که دارای طیف جذبی 2-8/1 بودند انتخاب شدند. شرایط واکنش pcr شامل 5/2 میکرولیتر از pcr buffer 10x، 50 نانوگرم dna، 2 میلی مول 2mgcl، 5/17 پیکومول آغازگر، 2/0 میکرولیتر dntpmix ،یک واحد تک پلیمراز در هر واکنش 25 میکرولیتری بود. آغازگرها از شرکت سیناژن (جدول 2) و سایر مواد مورد استفاده از شرکت fermentaz تهیه شده بود. تکثیر در ترموسایکلر گرادیان مدل biometra تحت شرایط زیر انجام گرفت. دناتوره شدن اولیه در 94 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه و 35 سیکل دیگر دناتوره شدن بعدی در 94 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه انجام گردید. مرحله اتصال در دمای 36 درجه سانتیگراد به مدت5/1 دقیقه و مرحله گسترش در 72 درجه سانتیگراد به مدت2 دقیقه و مرحله گسترش نهایی در 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انجام شد. پس از پایان تکثیر، محصولات pcr به نسبت 5 به 1 نمونه و بافر راهنمایx 6 تهیه شده از شرکت fermentaz مخلوط گردید. سپس روی ژل آگارز 2/1 درصد و بافرx tbe5/. تحت ولتاژ ثابت 75 ولت به مدت 150 دقیقه الکتروفورز شد. از dna ladder 100bp و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید 5/0 میلی گرم در لیتر، به مدت 10 دقیقه و سپس رنگ بری به مدت 5 دقیقه با استفاده از آب مقطر برای تشخیص و مشاهده باندها استفاده گردید. عکسبرداری از ژل الکتروفورز با استفاده از دستگاه uv-transilluminator در شدت نور یکسان انجام شد. عکسهای بدست آمده از دستگاه عکسبرداری ار ژل با استفاده از نرم افزارv.l. labworks تجزیه و تحلیل گردید و تنها باندهای قوی انتخاب و به کدهای صفر و یک تبدیل، و پس از انتقال به برنامه excel97، تنها مکانهایی که چند شکلی نشان داده بودند برای انجام محاسبات بعدی انتخاب شدند. جهت تعیین میزان پلی مورفیسم و تنوع ژنی از نرم افزار popgene 32 استفاده گردید . تجزیه براساس محورهای مختصات (pcoa) با استفاده از نرم افزار genalex 6.1 انجام گرفت و با دو مولفه اول که بیشترین درصد تنوع ژنی را توجیه می کردند نمودار دوبعدی جهت گروه بندی و بررسی روابط بین نمونه ها ترسیم شد . نتایج و بحث تجزیه rapd بیست نمونه گلرنگ با استفاده از 17 آغازگرتصادفی، مجموعاً 279 باند قابل امتیاز دهی ایجاد کرد که اندازه آنها در محدوده 100 تا bp 3000 بود شکل . در این بین 256 باند، چند شکلی نشان دادند (91%). میانگین تعداد باندهای تکثیر شده به ازای هر آغازگر41/16 و میانگین تعداد باندهای چند شکل به ازای هر آغازگر05/15 بود. توانایی آغازگرهای مختلف در آشکارسازی چند شکلی در بین نمونه های گلرنگ متغیر بود. در این میان، آغازگر ubp و ub18 ub25 وub96 دارای بیشترین تعداد باند چند شکل (18 باند) و آغازگرub91 و ub12دارای کمترین تعداد باند چند شکل (11 عدد) بودند. متوسط تعداد آلل موثر در هر لوکوس (ne) برای تمام آغازگرها 64/1 بود که با توجه به نزدیک بودن این عدد به تعداد آلل واقعی یعنی98/1، دلیل بر تأثیر خوب آللها در چندشکلی بالا و برآورد تنوع ژنتیکی می باشد. شاخص تنوع ژنی بر اساس داده های بدست آمده از هر آغازگر بین 326/0 و 605/0 متغیر بود. کمترین مقدار pic برای آغازگر ub30 و بیشترین مقدار pic برای آغازگرub96 محاسبه شد. بطور کلی از میان 256 باند چند شکل، 130 عدد از باندها 4/0 ? pic داشتند. بعبارت دیگر 1/51% از باندهای rapd ، بطور معنی داری در تمایز ژنتیکی بین نمونه ها شرکت داشتند. بر اساس داده های rapd ، فاصله ژنتیکی بین توده ها از 241/0 تا 863/0 متغیر بود. توده های 18و20 درکمترین فاصله ژنتیکی نسبت به هم (241/0) و توده های 1و15 در دورترین فاصله نسبت به هم (863/0) قرار داشتند. در این مطالعه همانطور که انتظار داشتیم یک رابطه منطقی میان فاصله جغرافیایی نمونه های گلرنگ خارجی و چند نمونه گلرنگ ایرانی با فواصل ژنتیکی آنها مشاهده شد. در ارقام داخلی تطابق خوبی بین فاصله جفرافیایی و تنوع ژنتیکی وجود ندارد، که میتوان علت آن را منشاء یکسان توده های جمع آوری شده از شهرستانهای مختلف دانست و تنها مهاجرت ها و انتقال های جغرافیایی موجب نامگذاری متفاوت آنها شده است . آنالیزهای مولکولی rapd نشان داد که هیچ کدام از نمونه ها در گروه جداگانه ای که فاصله قابل توجهی با سایر گروه ها داشته باشد گروه بندی نشده اند. چرا که در اینصورت هم باید گروه بندی کاملا تفکیک شده ای مشاهده می شد. دندوگرام حاصل که با استفاده از نرم افزار popgen32 و به روش فاصله upgma رسم شده بود در فاصله ژنتیکی 85% ، سه گروه اصلی را در بین 20 نمونه گلرنگ مشخص کرد . گروه یک شامل دو رقم خارجی و 2 رقم بومی داخلی و یک رقم اصلاح شده داخلی بود، که رقم 1 و 2 با توجه به نمودار در فاصله بیشتری نسبت به رقم 3 و 4 و 5 قرار دارند. هر چند قرار گرفتن ارقام خارجی و داخلی در یک گروه بیانگر وجود شباهتهایی است ولی دو رقم خارجی با فاصله زیادی از ارقام داخلی در یک گروه قرار گرفته اند که نشان دهنده تفاوت ژنتیکی آن دو با ارقام داخلی ایران است. گروه دو شامل ارقام داخلی است و به دو گروه تقسیم میشوند که شامل ارقام زراعی محلی و ارقام اصلاح شده داخلی میباشد.همانطور که در شکل شماره 2 مشاهده می شود، در ارقام داخلی تفاوت ژنتیکی زیادی وجود دارد. که با توجه به اینکه گلرنگ بومی ایران است، وجود تنوع زیاد و فاصله زیاد ژنتیکی بین ارقام داخلی دور از انتظار نمی باشد. گروه سوم نیز شامل دو رقم اصلاح شده ایرانی اصفهان و رقم kw4 بود. بیشترین فاصله ژنتیکی بر اساس شکل شماره 2 و داده های ماتریس شباهت بین ارقام خارجی 3 و1 و ارقام داخلی 15و 13 (متوسط:7841/.) می باشد. و کمترین فاصله میان ارقام 18 و 20 می باشد (2419/0). داده ها نشان دهنده فاصله ُژنتیکی زیاد (863/.) ارقام داخلی با ارقام خارجی می باشد که می توان از این رقمهای دور از هم در تولید بذر هیبرید استفاده کرد. از طرفی وجود فاصله زیاد (7461/.) در برخی ارقام داخلی ایران نشاندهنده تفاوت ژنتیکی این ژنوتیپها و همچنین پتانسیل بالای ذخایر ژنتیکی داخلی در تولید هیبریدهای مناسب می باشد. نمودار دو بعدی حاصل از pcoa نیز (شکل ) توانست سه گروه اصلی گلرنگ را کاملاً از هم تفکیک کند که تأیید کننده نتایج حاصل از تجزیه خوشه ای می باشد. سه گروه مشاهده شده عبارتند از: گروه (1) شامل دو رقم خارجی میباشد. گروه (2) شامل دو گروه کاملا جدا مانند آنچه در نمودار خوشه ای دیده می شود میباشد. و گروه (3) نیز مانند نمودار خوشه-ای شامل دو رقم بومی اصفهان و kw4 که یک رقم اصلاح شده ایرانی هست میباشد. همانگونه که مشاهده می شود با وجود قرار گرفتن این دو ژنوتیپ در یک گروه، اما فاصله آنها با هم نسبتا زیاد می باشد که نشان می دهد آنها قرابت کمی با هم دارند که بیانگر وجودتنوع زیاد ارقام داخلی و امکان استفاده ازارقام محلی داخلی در تولید هیبرید های مناسب است. در این نمودارمانند نمودار خوشه ای همچنان بیشترین فاصله بین ژنوتیپ 15 با سایر ژنوتیپها دیده می شود و همچنین فاصله زیادی بین ژنوتیپهای 1 و 3 با ژنوتیپهای اصلاح شده داخلی و زراعی ایران مشاهده می شود. با وجودیکه این دو رقم در نمودار خوشه ای با سه رقم ایرانی در یک گروه ولی با فاصله زیاد قرار گرفتند، ولی در نمودار دوبعدی این دو رقم کاملا جدا از ارقام ایرانی می باشند. در حالیکه سه رقم ایرانی کاملا نزدیک به ارقام ایرانی قرار گرفته اند که بیانگر قرابت و خویشاوندی ارقام ایرانی و احتمال قرابت دور ارقام خارجی با برخی از ارقام داخلی می باشد. بحث در این مطالعه همانطور که انتظار می رفت میان پراکنش جغرافیایی نمونه های گلرنگ خارجی و چند نمونه گلرنگ ایرانی با فواصل ژنتیکی آنها ارتباط منطقی وجود دارد. که میتوان از این تفاوت ژنتیکی در تولید ارقام هیبرید استفاده کرد. از طرفی در برخی ارقام داخلی شاهد فاصله زیاد هستیم که نشان دهنده تنوع ژنتیکی زیاد ارقام داخلی با هم می باشد، در حالیکه در تعداد دیگری چنین تطابقی مشاهده نشد. میتوان علت آن را وجود منشا مشترک برای آنها در نظر گرفت که با مهاجرت و انتقال جغرافیایی تغییراتی کرده اند . در مطالعاتی که توسط معالی و همکاران انجام شد عدم تطابق فاصله ژنتیکی و فاصله جغرافیایی تاییدشد.در صورتیکه تفاوت چشمگیری برای اکثر ارقام ایرانی با ارقام خارجی وجود دارد . همچنین عدم تطابق بین فاصله ژنتیکی و فاصله جغرافیایی در سایر مطالعات نیز تائید شده-است . اطلاع از فاصله های ژنتیکی می تواند در برنامه های اصلاحی مخصوصا در انتخاب والدین برای تلاقیها مفید باشد. این مطالعه نشان داد که، روش rapd ابزار مناسبی در جهت تشخیص تنوع داخل گونه ای و روابط ژنتیکی بین گونه ای برای استفاده در اصلاح گونه ها ارائه می دهد.