بررسی کلون سازی و بیان ‍ن کیتیناز در باسیلوس سوبتیلیس wasd جهت تولید آفت کش های بیولو‍یکی

چکیده : بیماریهای قارچی سالانه خسارات فراوانی به محصولات کشاورزی وارد می کنند. با توجه به اهمیت بیماری های ایجاد شده توسط قارچهای گیاهی مختلف و بالا بودن خسارات آنها بر روی برنج، گندم و کلزا ودیگر محصولات کشاورزی ، بررسی راه های مقابله با این قارچ ها و اتخاذ استراتژی های مناسب در مدیریت و کنترل این بیماری ها ضروری است. یکی از استراتژی هایی که امروزه مورد توجه می باشد، استفاده از میکروارگانیسم هایی است که توانایی هیدرولیز کردن دیواره ی این قارچ ها را دارند. در بیشتر مواقع میکروارگانیسم های جدا شده از خاک نا شناخته بوده و احتمال می رود استفاده از آنها در طبیعت موجب بروز اختلال در چرخه ی طبیعت شود.بنابراین در این تحقیق ژن کتیناز s باسیلوس پومیلوس کلون و به باکتری باسیلوس سوبتیلیس wasd ،یک باکتری جدا شده از خاک که اطلاعات بسیاری در مورد آن بدست آمده و در لیست باکتری های بی خطر fdaو دیگر سازمان های جهانی مانند فائو قرار دارد، ترانسفورم شد. bacillus pumilus دارای دو ژن کیتیناز به نام هایchis و chil است ،که در این پروژه فقط ژن chis مورد بررسی قرار گرفت. در روند کلونیک از e.coli(top10) بعنوان گیرنده استفاده شد سپس پلاسمید ساخته شده، با متود ترانسفورم طبیعی((natural transformation به باسیلوس سوبتیلیس wasd ترانسفورم گردید و بیان ژن کیتیناز و فعالیت آن از طریق ایجاد هاله ی شفاف دور باکتری بر روی محیط پایه ی m9 مدیفای شده به همراه کیتین کلوئیدی مشاهده شد. آزمایشات بیشتر شامل sds-page و آنالیز وسترن بلاتینگ بیان پروتئین کیتیناز را اثبات نمود. میزان فعالیت آنزیم با روش میلر اندازه گیری شد ، برای بررسی اثرات ضد قارچی آنزیم کیتیناز تولید شده توسط باسیلوس سوبتیلیس بر روی یک سری از قارچهای بیماریزای گیاهی ، پس از کشت باکتری حاوی سازه ژنی نوترکیب و تولید آنزیم ، آنزیم بوسیله ی آمونیم سولفات رسوب داده شد و سپس در بافر مناسب حل شد، نتایج حاکی از توقف رشد قارچهای بیماریزای گیاهی در مجاورت با این آنزیم بودند . در مرحله بعدی آنزیم کتیناز (chis )، با استفاده از ستون نیکل ni-nta برای محاسبه پارامترهای کینتیکی همچون ، km ،vmax وkcat ، خالص گردید. واژه های کلیدی:کیتیناز،باسیلوس پومیلوس،باسیلوس سوبتیلیس wasd ،بیماریهای قارچی.