کلونینگ، بیان و تعیین خصوصیات آنزیم متیل گلی اکسال سنتاز از گونه thermus sp. gh5 و بررسی رفتار آلوستریکی آنزیم با جهش زایی هدفمند

آنزیم متیل گلی اکسال سنتاز (mgs) از گروه لیازها بوده و یک آنزیم متابولیسمی می باشد. این آنزیم با تبدیل دی هیدروکسی استون فسفات به متیل گلی اکسال گلیکولیز را از مسیر خویش منحرف می سازد. در این تحقیق ژن رمزدهی کننده mgs از گونه thermus sp. gh5 (tmgs) کلون، تعیین ترادف و بیان گردیده و سپس توسط کروماتوگرافی تعویض یونی و با استفاده از رزین q- سفاروز تخلیص گردید. ژن tmgs 399 جفت باز داشته و پلی پپتیدی با 132 آمینواسید و با وزن مولکولی 3/14 کیلو دالتون را رمزدهی می کند. km و kcat آنزیم tmgs به ترتیب 56/0 میلی مولار و (s-1) 325 می باشد که شبیه به آنزیم mgs از e. coli می باشد. ph بهینه و دمای بهینه برای فعالیت tmgs به ترتیب 6 و 75 درجه سانتیگراد می باشد. مقایسه ترادف آمینواسیدی و ضریب هیل mgs از e. coli و tmgs نشان می دهد که نبود آرژینین 150 در tmgs باعث کاهش در تعاونی بین زیر واحدها در حضور فسفات به عنوان مهار کننده آلوستریک شده است. نتایج فیلتراسیون ژلی نشان داد که tmgs آنزیم هوموهگزامر بوده و ساختار چهارم آن در حضور فسفات تغییر نمی یابد. تاثیر متابولیت های مختلف بر روی فعالیت آنزیم نشان داد که nadh با مهار tmgs می تواند نقشی در تنطیم شانت متیل گلی اکسال داشته باشد. عامل بروز رفتار آلوستریک در آنزیم tmgs آمینواسیدهای دخیل در مسیر انتقال تغییرات آلوستریک بین زیر واحدهای آنزیم یعنی 82 pro، 97 arg، 101 val و 101 asp می باشد. برای بررسی این مسیر با جهش زایی هدفمند، جهش یافته های k97r، s101v، i101v و a101v ساخته شد. تعیین خصوصیات سینتیکی نشان داد که همکاری بین زیر واحدها در حضور فسفات و بدون حضور فسفات در جهش یافته های k97r، s101v، i101v یکسان بوده و بنابراین در این جهش یافته ها تعاونی بین زیر واحدها در حضور فسفات از بین رفته اما در جهش یافته a101v دیده شد که تعاونی بین زیر واحدها باقی مانده است. همچنین در این جهش یافته ها دیده شد که به موازات کاهش لگاریتمی در کارایی کاتالیتیکی ضریب هیل (تعاونی بین زیر واحدها) افزایش می یابد.