خالص سازی و مطالعه پایداری آنزیم لوسیفراز firefly در حضور حلالهای آلی

در این پروژه به بررسی پایداری و خواص سینتیکس آنزیم لوسیفراز در حضور حلالهای آلی پرداختیم. از آنجا که آنزیمها در حلالهای مختلف کارایی کاتالیتیکیkcat/km)) متفاوتی از خود نشان می دهند؛ بنابراین پایداری فعالیت آنها در حلالهای مختلف متفاوت است . فورمامید: چنانچه طیف فلورسانس نشان می دهد به نظر می رسد که ساختار باز شده و فورمامید سبب واسرشتگی ساختار آنزیم شده است همچنین، در حضور فورمامید غلظت v/v 1% فورمامید، دمای بهینه فعالیت آنزیم بالاتر رفته و حدود c°30 است (دمای بهینه فعالیت آنزیم بدون وجود حلال های آلی c° 25 است). در حضور غلظت (v/v) 1% فورمامید فعالیت افزایش یافته و هر چه غلظت بالاتر می رود فعالیت کاهش می یابد؛اما نمودار پایداری حرارتی متناسب با کنترل سیر نزولی دارد .در حضور غلظت (v/v) 10% ، ph بهینه و پایداری آنزیم در برابر تغییرات ph تغییری نشان نمی دهد (8/7 ph )سرعت کاهش نشر نور نیز در حضور فورمامید نسبت به نمونه کنترل کاهش می یابد. اتانول: بررسی طیف فلورسانس آنزیم در حضور اتانول نشان می دهد که در غلظتهای پایین اتانول(تا حدود (v/v) 10% )، به شدت فلورسانس ذاتی کاهش می یابد ولی با افزایش تدریجی در صد اتانول، ساختار آنزیم به حالت کنترل نزدیک می شود .دمای بهینه فعالیت آنزیم و پایداری حرارتی در غلظت های مختلف اتانول تغییری نشان نمی دهد و تنها فعالیت آنزیم کاهش یافته است. ph بهینه فعالیت آنزیم در حضور اتانول در مقایسه با نمونه کنترل کاهش نشان می دهد(7) .اما پایداری آنزیم در برابر تغییرات ph کمی بیشتر می شود. سرعت کاهش نشر نور نیز کاهش می یابد. اتیلن شدت فلور سانس به طور منظم با افزایش در صد اتیلن گلیکول افزایش می یابد همچنین طبق بررسی طیف cd ساختار دوم آنزیم هم تغییر می کند و با افزایش درصد اتیلن گلیکول فعالیت آنزیم نیز کاهش نشان می دهد. دمای بهینه و پایداری حرارتی در حضور اتیلن گلیکول نسبت به نمونه کنترل تغییری نشان نمی دهد و تنها فعالیت آنزیم کمتر می شود و نمودارهای پایداری حرارتی متناسب با نمونه کنترل کاهش می یابند. ph بهینه فعالیت آنزیم افزایش یافته(ph=8) اما پایداری آنزیم در برابر تغییرات ph تغییری نشان نمی دهد. سرعت کاهش نشر نور در حضور اتیلن گلیکول کاهش می یابد . dmso : در مورد dmso نیز در طیف فلورسانس در ابتدا با افزایش در صد دی متیل سولفوکسید، شدت فلورسانس کاهش یافته و پس از آن با افزایش آن شدت طیف افزایش می یابد. دمای بهینه فعالیت آنزیم در حضورdmso نسبت به نمونه کنترل افزایش تا حدود ?c 30 و پایداری حرارتی به خصوص غلظت (v/v) 15% افزایش نشان می دهد. ph بهینه فعالیت آنزیم در حضور غلظت 10% dmso در محدوده گسترده تری است و پایداری آنزیم در برابر تغییرات ph افزایش می یابد .سرعت کاهش نشر نور با افزایش غلظت dmso کاهش می یابد .