بیان سطحی آنزیم کیتیناز در باکتری باسیلوس سوبتیلیس با استفاده از سیستم آنزیمی سورتاز به منظور تولید یک قارچکش طبیعی

در سال های اخیر، تغییر سطح سلول های زنده کاربردهای فراوانی در زمینه های بیوتکنولوژی، ایمونولوژی و میکروبیولوژی داشته است. در این بین تغییر سطح سلول های باکتریایی به عنوان مهمترین میکرو ارگانیسم های مورد استفاده در صنایع بیوتکنولوژی، مورد علاقه محققین بسیاری بوده است. بیان و اتصال پروتئین های هترولوگ به سطح سلول، یکی از راه های تغییر سطح سلول های باکتریایی می باشد. در باکتری های گرم مثبت، یک یا دو آنزیم با عنوان سورتاز وجود دارد که اتصال سوبسترای پروتئینی به دیواره سلول را با ایجاد یک پیوند کووالان کاتالیز می کند. این آنزیم با تشخیص توالی آمینو اسیدی با عنوان موتیف شناسایی آنزیم سورتاز که در انتهای کربوکسیل پروتئین سوبسترا قرار دارد، در یک واکنش ترانس پپتیدازی آن را شکسته و پروتئین سوبسترا را به لایه پپتیدوگلیکانی دیواره سلولی متصل می کند. در باکتری باسیلوس سوبتیلیس، دو سورتاز مختلف با عنوان yhcs و ywpe گزارش شده است، اما هنوز هیچ سوبسترای پروتئینی که توسط این آنزیم یه دیواره سلولی باکتری متصل شوند، شناسایی نشده است. با این وجود ارتباط yhcs با دو پروتئین با عنوان yhcr و yfkn که در انتهای کربوکسیل خود توالی مشابه موتیف شناسایی آنزیم سورتاز دارند، تایید شده است. در این تحقیق به منظور شناسایی سیستم آنزیمی سورتاز در باکتری باسیلوس سوبتیلیس، سعی شد با استفاده از آنزیم سورتازyhcs ، پروتئین کیتیناز که در انتهای کربوکسیل آن موتیف شناسایی آنزیم سورتاز در پروتئین yhcr اضافه شده بود، به سطح باکتری باسیلوس سوبتیلیس متصل شود تا بتوان در کنترل بیولوژیک عوامل بیماری زای گیاهی در سطح مزارع از آن استفاده کرد. برای رسیدن به این هدف، ابتدا سعی شد ژن کد کننده آنزیم yhcs به همراه ژن کد کننده آنزیم chitinase که در انتهای کربوکسیل آن موتیف شناسایی آنزیم سورتاز از پروتئین yhcr اضافه شده بود، درون وکتور بیانی جاسازی شده و تغییرات سطح سلول باکتری، پس از ورود وکتور به آن با تکنیک های sds-page، western blotting و flow cytometery بررسی شود. نتایج این بخش از آزمایشات حاکی از آن بود که پروتئین کیتیناز به طور موفقیت آمیزی به سطح باکتری متصل شده و فعالیت کیتینازی از خود نشان می دهد. در ادامه ی آزمایشات، یک سوبسترای پروتئینی طراحی شد که در قسمت میانی آن توالی شناسایی آنزیم سورتاز در پروتئین yhcr جا سازی شده بود. این سوبسترای پروتئینی به همراه آنزیم سورتاز yhcs توسط روش کروماتوگرافی ستون نیکل خالص سازی شدند و بر هم کنش آنها در محیط in vitro مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بخش از آزمایشات نشان دهنده ی آن بود که آنزیم yhcs به تنهایی قادر به انجام عمل ترانس پپتیدازی در محیط بیرون از سلول زنده نیست و برای فعالیت خود احتیاج به عوامل دیگری نیز دارد. به طور کلی نتایج این تحقیق روشن شدن بخشی از سیستم آنزیمی سورتاز در باکتری باسیلوس سوبتیلیس بود که در آن آنزیم سورتاز yhcs و موتیف شناسایی آنزیم سورتاز در پروتئین yhcr نقش کلیدی را ایفا می کنند.