ارزیابی ایمونولوژیکی آنتی سرم منو اسپاسفیک pichia pastoris بعنوان فاز جامد در روش الایزا جهت تشخیص آلودگی احتمالی به سلول میزبان در واکسن نوترکیب هپاتیت - b

بر اساس رعایت قوانین اصول gmp ،یکی از موارد مهم در تولید فراورده های بیولوژیک نوترکیب دقت در کنترل کیفیت محصول نهائی به ویژه سنجش میزان آلودگی ماکروملکول های جسم سلولی میزبان در محصول نهائی است.از آنجا که واکسن هپاتیت_b خود پروتئین سطحی از کپسید ویروس مربوطه است و امروزه واکسن نوترکیب آن را توسط پیشیا پاستوریز مهندسی شده تولید می نمایند،بررسی مولکولی ، شناسائی و سنجش میزان آلودگی پروتئین های سلول میزبان در واکسن هپاتیت_bیکی از آزمون های کلیدی کنترل کیفی آن به شمار میرود. بنابراین شناسائی و سنجش پروتئین های ناخواسته در واکسن هپاتیت_bتوسط کیت های استاندارد و قابل اعتماد از اهمیت بالائی برخوردار است ، بطوریکه طبق پروتکل سازمان جهانی بهداشت ، فارماکوپه ایران و فارماکوپه های معتبر خارجی میزان آلودگی نباید بیش از 1/0 میکروگرم در یک دوز واکسن باشد.در حال حاضر شرکت های متعددی جهت شناسائی و سنجش میزان آلودگی پروتئین سلول میزبان در واکسن هپاتیت_b کیت های تجاری مختلفی را جهت بکارگیری در روش های الایزا و وسترن بلات تولید و به بازار عرضه می نمایند.اما قیمت بالا ، کیفیت تجاری و بعضا" حساسیت مختلف و عدم دسترسی سهل به این کیت ها مشکلات کم و بیش پیچیده ای را برای کنترل کنندگان واکسن هپاتیت_b نوترکیب ایجاد نموده است .بنابراین بنظر می رسد تولید و یا در اختیار داشتن کیت استانداردی درکشور که از آنتی بادی پلی کلونال منواسپسفیک بجای پلی کلونال کلاسیک استفاده گردیده باشد نه تنها حساسیت و ویژگی آزمون های مربوطه را بطور قابل ملاحظه ای افزایش می یابد بلکه خود حرکتی است در جهت خود کفائی و جلوگیری از خروج ارز ممکلتی . بعلاوه نتیجه این تحقیقات می تواند به عنوان الگوئی در تشخیص سرولوژیک بیماری های عفونی و تحقیقات نیز مورد استفاده قرار گیرد. در تحقیقات حاضر ابتدا تعلیق غلیظی از پیشا پاستوریز در بافر فسفات نمکی(5/7=ph)تهیه گردید.سپس سلول ها توسط دستگاه بید _میل شکسته شد.5/0 میلی لیتر از سلول لیز شده را همراه با 5/0 میلی لیتر ادجوانت فروند در روزهای 14،0و28 از طریق زیر جلدی به دو راس خرگوش تزریق گردید.پس از یک هفته استراحت سرم خون خرگوش ها را با استفاده از دو روش رسوب با سولفات آمونیوم اشباءواستفاده از اسید کاپریلیک ایمونوگلوبین استخراج شده و کروماتوگرافی تعویض یونی خالص گردید.البته آزمون های کنترل کیفی نشان داد که igg خالص شده از طریق اسید کاپریلیک دارای درجه خلوص 97% ودرصد خلوصigg خالص شده به روش سولفات آمونیوم اشباء 77% می باشد . سپس آنتی بادی های ناخالص از طریق جسم سلولی ساکارومیسس سرویسه جذب گردیدند. از آنتی بادی منواسپسفیک تهیه شده ، جهت سنجش میزان آلودگی 24 نمونه مختلف واکسن هپاتیت_b تولید شده،آزمون الایزا و ایمنوبلات استاندارد شده در لابراتوار، استفاده گردید.ضمنا" همزمان نتایج حاصله با چهار کیت تجاری مقایسه گردید. مقایسه آنتی بادی منواسپسفیک با کیت تجاری توسط برنامه آماریgraphpad prism(version 3) با استفاده از جامعه آماری 24 نفره نشان داد تفاوت معنی داری بین نتایج حاصله از آنتی بادی منواسپسفیک با کیت تجاری وجود دارد بطوریکه مقدار 0001/0 = p با22= df می باشد.نتایج حاصله بطور واضح نشان می دهد که تهیه آنتی بادی منواسپسفیک و استفاده از آن در آزمون های الایزا و ایمونوبلات برای تشخیص و تعیین میزان آلودگی پروتئین های سلول میزبان در واکسن هپاتیت_b نه تنها در سنجش کیفیت محصول نهائی موثر است بلکه گام مثبتی است در حذف هزینه های گزاف و خروج ارز مملکتی