بررسی خصوصیات بیولوژیکی و مولکولی جدایه ایرانی ویروس v سیب زمینی

ویروس v سیب زمینی ( pvv ) potato virus v ازخانواده پوتی ویریده وجنس پوتی ویروس می باشد. پیکره های آن شامل یک کپسید باتقارن شش وجهی و رشته ای خمش پذیر با طول 760 نانومتر است. ویروس v سیب زمینی دارای ژنوم rna تک لا، مثبت وتک رشته ای که حاوی9851 نوکلئوتید می باشد. ژنوم این ویروس دارای یک قاب خواندنی بزرگ (orf) بوده، که قسمت های اصلی ژنوم آن به ترتیب عبارتند از 1-viral protein genome (vpg) که درتماس باانتهای َ5 می باشد. 2- منطقه ترجمه نشده (non translated region) غنی از اوراسیل وآدنین می باشد. 3- یک قاب خواندنی بزرگ متشکل از9201 که به یک پلی پروتئین بزرگ در حدود 3067 اسیدآمینه ترجمه می شود. 4 - منطقه ترجمه نشده ( ntrَ3) که به انتهای پلی a ختم می شود. در مطالعه ای که به منظور بررسی پراکندگی ویروس v سیب زمینی در طول سال های زراعی 1386 تا 1387 از مزارع سیب زمینی استان های کرمان و همدان انجام گرفت. تعداد 360 نمونه گیاهی دارای علائم ویروسی از مزارع سیب زمینی استان های فوق الذکر جمع آوری شد. جهت تأیید آلودگی نمونه ها از آزمون های الایزا استفاده گردید. نتایج به دست آمده از این آزمون ها بیانگر گسترش بسیار محدود pvv در مزارع سیب زمینی در این دو استان می باشد. به طوریکه در استان کرمان تنها سه نمونه آلوده بهpvv به دست آمد. جهت بررسی دامنه میزبانی جدایه مورد نظر، از گیاهان آزمون متعلق به خانواده های chenopodiaceae, amarantaceae و solanaceaeاستفاده گردید. از بین گیاهان مورد استفاده، تنها n. tabacum cv.whiteburley و debneyi nicotiana پس از گذشت 30 -45 روز علائم ویروسی را نشان دادند. در حالیکه گیاهان آزمون از سایر خانواده ها هیچ گونه علائمی نسبت به این ویروس نشان ندادند. نتایج آزمون الایزا نیز موید این مطلب می باشد. علائم pvv بر روی توتون های مایه زنی شده رقم debneyi nicotiana در گلخانه به صورت رگبرگ نواری و در رقم n. tabacum cv. whiteburley به صورت رگبرگ روشنی و موزاییک دیده شد. از آنجایکه این تحقیق اولین گزارش از وجود pvv در مزارع سیب زمینی ایران می باشد، بر همین اساس در مورد ویروس v سیب زمینی در کشور ما تا پیش از این تحقیق، هیچ گونه مطالعه بیولوژیکی و مولکولی انجام نگرفته است. لذا اهداف اصلی این تحقیق، علاوه بر مطالعه بیولوژیکی، بررسی ژنوم کامل ویروس pvv و مقایسه جدایه ایرانی این ویروس با جدایه های گزارش شده در دنیا می باشد. بر این اساس جدایه مجزا شده از مزارع سیب زمینی منطقه لاله زارکرمان به منظور مطالعه ژنوم کامل ویروس انتخاب گردید. به منظور تکثیر ژنوم کامل ویروس تعداد 11 آغازگر بر اساس جدایه dv42طراحی گردید. پس از عمل rt-pcr ، همسانه سازی، تعیین توالی ژنوم این ویروس، درخت فیلوژنیک به منظور مقایسه جدایه ایرانی و جدایه های گزارش شده در بانک ژن با استفاده از نرم افزار dnaman version4.02 (lynnon biosoft.1994-98) رسم گردید. در تمامی موارد درصد همولوژی، ترادف نوکلئوتیدی و اسید های آمینه نیز محاسبه گردید. به دلیل اینکه تنها یک ژنوم کامل در بانک ژن موجود می باشد، لذا به ناچار ژن های تکثیر شده جدایه ایرانی pvv (به جز ژن cp) با ژنوم مذکور مقایسه و درصد ترادف نوکلئوتیدی جهت ژن های nib ، nia، 6k1، vpg، ci، p3 به ترتیب 8/92، 94، 8/94، 5/91، 93 و6/93 بدست آمد. درصد ترادف اسید آمینه ها ی ژن های nib ، nia، 6k1، vpg، ci، p3 نیز به ترتیب 2/94، 2/95، 100، 6/93، 5/98 و 2/97 محاسبه گردید. در مورد cp به دلیل وجود تعدادی از جدایه های موجود در بانک جهانی ژن، مقایسه ای بین cp جدایه ایرانی و جدایه های موجود در بانک ژن صورت گرفت. براساس این نتایج، بیشترین درصد تشابه مربوط به توالی نوکلئوتیدی پروتئین پوششی جدایه ایرانی pvv و جدایه های swedish ، soumi و 506dutchگزارش شده از کشور های سوئد، فلاند و هلند به ترتیب میزان 8/96، 7/96 و 6/96درصد می باشد و کمترین میزان تشابه توالی نوکلئوتیدی پروتئین پوششی بین جدایه ایرانی با جدایه ای از کشور پرو(pa1.1) به میزان 6/89 درصد تعیین گردید. بیشترین درصد تشابه توالی نوکلئوتیدی در بین جدایه های جهانی، مربوط به جدایه pa1 از کشور پرو واقع در گروه i و جدایه ای دیگر از همین کشور pa1.1 به میزان 9/99 درصد می باشد. همچنین کمترین میزان تشابه توالی نوکلئوتیدی بین جدایه های جهانی ، بین جدایه انگلیس m97uk وringeriks از نوروژ با جدایه دیگری از کشور پرو(pa1) به میزان 5/89 درصدبدست آمد. برطبق نتایج به دست آمده، بیشترین درصد تشابه اسیدآمینه های ژن پروتئین پوششی بین جدایه ایرانی pvv و جدایه swedish گزارش شده از کشور های سوئد به میزان 8/98 درصد می باشد. همچنین بیشترین تشابه اسیدآمینه های ژن پروتئین پوششی در بین جدایه های جهانی، مربوط به جدایه pa1 از کشور پرو و جدایه ای دیگر از همین کشور pa1.1 به میزان 6/99 درصد می باشد. کمترین میزان تشابه اسیدآمینه های ژن پروتئین پوششی بین جدایه ایرانی با جدایه ای از کشور پرو(pa1.1) به میزان 5/95 درصد تعیین گردید. همچنین کمترین میزان تشابه اسیدآمینه های ژن پروتئین پوششی بین جدایه های جهانی ، مربوط به جدایه m97uk از (انگلیس)، dv42 از (اروپا) و 506dutch از(هلند) با جدایه دیگری از کشور پرو(pa1) به میزان 4/94 درصد می باشد. درخت فیلوژنیک بر اساس توالی نوکلئوتیدی ژن پروتئین پوششی رسم گردید. نتایج حاصله بیانگر آن است که جدایه های pvv موجود در بانک ژن به دو گروه i و ii تقسیم می گردند. در گروه i تنها دو جدایه از کشور پرو(pa1 و pa1.1) قرار گرفتند که با bootstrap100% از گروه ii که شامل اکثریت جدایه های گزارش شده از دنیا میباشد ، متمایز گردیدند. گروه ii نیز خود به زیر گروههای بیشتری تقسیم گردید که جدایه ایرانی pvv در زیر گروه ii به صورت یک زیر شاخه مجزا قرار می گیرد. نتایج به دست آمده بیانگر آن است که درصد مشابهت ترادف های نوکلئوتیدی قطعه پروتئین پوششی بین جدایه های گزارش از مناطق مختلف دنیا بالا می باشد. همچنین میزان درصد مشابهت ترادف نوکلئوتیدی قطعه پروتئین پوششی بین جدایه گزارش شده از ایران با جدایه گزارش شده از سوئد به میزان 8/96 درصد می باشد. این نتایج بیانگر آن است که به طور کلی pvv در مزارع سیب زمینی ایران از گسترش محدودی برخوردار بوده و درصد مشابهت ژن های متعدد این ویروس با تنها جدایه گزارش شده در دنیا نیز در سطح بالائی می باشد. بر این اساس می توان نتیجه گرفت که احتمالا آلودگی مزارع سیب زمینی ایران نسبت به pvv مربوط به ورود این ویروس به همراه غده های آلوده سیب زمینی از کشورهای اروپائی می باشد.