انتقال ژن مقاومت به علف کش گلایفوسیت و آنالیز مولکولی گیاهان تراریخت در چغندرقند

چغندرقند، گیاهی است که دستکاری ژنتیکی آن به سختی صورت می گیرد. یک روش ساده و مؤثر باززایی گیاه می تواند موجب تسهیل در انتقال ژن به چغندرقند گردد. در این تحقیق، جوانه های انتهایی چغندرقند از خانواده نیمه فامیلی تک جوانه 26p-9597 تهیه و در پیش تیمارهای هورمونی مختلف کشت شدند و از نوساقه های حاصل، ریزنمونه های برگی تهیه گردید. این ریزنمونه ها در محیط کشت گیاهی با تیمارهای مختلف هورمونی کشت شدند و سپس درصد ریزنمونه های برگی پاسخ ده به باززایی نوساقه تعیین شد. برگ های حاصل از پیش تیمار با mg/l bap 1 ظرفیت بالایی در تولید نوساقه نابجا (65/4%) داشتند، اما اثر تیمارهای هورمونی باززایی نوساقه بر صفت مورد مطالعه معنی دار نبود. در آزمایش دیگری، اثر 25 ژنوتیپ از خانواده نیمه فامیلی 26p-9597 چغندرقند (هر بذر به عنوان یک ژنوتیپ) نیز بر روی تشکیل نوساقه های نابجا بررسی گردید. نتایج آزمایش نشان داد که اختلاف معنی داری بین ژنوتیپ های مختلف چغندرقند داخل این خانواده نیمه فامیلی وجود دارد و انتخاب ژنوتیپ های با توان بالای باززایی نوساقه برای دستکاری های ژنتیکی امکان پذیر است، اگر چه ریزنمونه های رشد یافته در پیش تیمار mg/l bap 1، کمتر تحت تاثیر ژنوتیپ قرار گرفتند. در آزمایش های تراریختی، ژن epsps باکتریایی با دو جهش (epsps-2mut) که موجب بروز تحمل به علف کش گلایفوسیت می شود، به گیاه چغندرقند انتقال یافت. همچنین کارایی انتقال ژن از طریق باززایی مستقیم نوساقه با ژن گزارش گر gus بررسی گردید و امکان انتقال ژن به روش غوطه ور سازی گل آذین در چغندرقند مورد بررسی قرار گرفت. گیاهان تراریخت حاوی ژن epsps-2mut با آزمون های pcr، rt-pcr، dot blot وsouthern blot تأیید شدند و در شرایط درون شیشه ای و گلخانه ای نشان داده شد که ژن epsps-2mut، باعث ایجاد تحمل به علف کش گلایفوسیت در چغندرقند می گردد. در آزمایش های تراریختی از ژن های nptii، bar و epsps-2mut به عنوان ژن های گزینش گر استفاده گردید. با استفاده از آنتی بیوتیک کانامایسین به عنوان عامل گزینش گر، 36/6% نوساقه های باززایی شده مقاوم به کانامایسین بودند. کارایی انتخاب با کانامایسین 19/3% تعیین گردید. امکان استفاده از ژن epsps-2mut به عنوان ژن گزینش گر نیز بررسی گردید. مناسب ترین روش گزینش با علف کش گلایفوسیت در آزمایش های تراریختی، انتقال ریزنمونه های برگی 25-15 روز پس از تلقیح با آگروباکتریوم به محیط کشت حاوی mm 0/1گلایفوسیت به مدت 28 روز است. با این روش 13% نوساقه ها مقاوم به گلایفوسیت بودند و کارایی انتخاب به میزان 32% تعیین گردید. با استفاده از ژن گزارش گر gus، میزان فراوانی تراریختی در روش انتقال ژن بهینه شده 5/3% تعیین گردید. در آزمایش های انتقال ژن با اعمال پیش تیمار mg/l 1 هورمون bap در خانواده نیمه فامیلی 26- p9597، درصد ریزنمونه های پاسخ ده 61/9% و در لاین nf به میزان 92/8% بود. همچنین یک لاین ازb. maritima به میزان28/26% باززایی نوساقه نشان داد و میزان باززایی در یک هیبرید بین گونه ای67/02% بود. امکان بیان یک ژن در گیاه تراریخت به صورت کنترل شده، از نکات بسیار ارزشمند در دستکاری های ژنتیکی محسوب می شود. در این تحقیق، پروتوپلاست های سلول های محافظ روزنه از برگ های گیاه چغندرقند استخراج گردید و کالوس های بدست آمده از این پروتوپلاست ها، با اگروباکتریوم دارای سازه پیشبر القا شونده با اتانول و ژن گزارش گر gus تلقیح شدند. کالوس های حاصل از تراریختی با اتانول، در شرایط درون شیشه ای تیمار شده و بیان ژن گزارش گر gus در کالوس ها، در شرایط قبل و بعد از القا با اتانول، مورد بررسی قرار گرفت. برخی از کالوس ها پس از القا با اتانول، بیشترین میزان بیان ژنgus را داشتند در حالی که، قبل از القا با اتانول، هیچ گونه بیانی مشاهده نشد. بیان ژن گزارش گر gus در این کالوس ها، بالا و مشابه بیان ژن gus تحت کنترل پیشبر دایمیcamv 35s بود. بیان بالای ژن gus با القای اتانول و عدم بیان آن در شرایط قبل از القا، نشان دهنده کارایی این پیشبر در شرایط کنترل شده است.