بررسی افزایش بیان ژن های sat و cor در گیاهان تراریخته شقایق روغنی papaver somniferum (rence)

شقایق الی فرا papaver somniferum منبع اقتصادی مسکن های نارکوتیک، کدئین و مرفین می باشد. در کنار این دو مرفینان، گیاه شقایق الی فرا تقریبا" 80 آلکالوئید متعلق به خانواده های متنوع تتراهیدروبنزیل ایزوکوئینون را تولید می کنند. آلکالوئیدهای بنزوایزوکوئینی گروه متنوعی از ترکیبات ازت دار هستند که در 20 درصد گونه های گیاهی یافت می شوند. جداسازی ژن های موثر دخیل در بیوسنتز مرفین در گیاهان شقایق الی فرا جهت تولید آلکالوئیدهای ویژه دارای اهمیت بسیار می باشد. مهندسی متابولیک مسیرهای آلکالوئید گیاهی عموما" بدلیل محدودیت دسترسی به ژنهای بیوسنتزی کلون شده و عدم توانایی تراریختی گونه های تولیدکننده آلکالوئید محدود می باشد. اکنون مسیر سنتز آنزیمی مرفین در شقایق الی فرا بصورت کامل تشریح شده است. در مسیر بیوسنتزی، دو آنزیم کلیدی سالوتاردینول 7- اُ- استیل ترانسفراز یا sat که در تبدیل سالوتاردینول به سالوتاردینول 7-اُ- استات که پیش ماده اولیه تبائین است و کدئینون ردوکتاز یا (cor) که آنزیم ماقبل آخر و آنزیم نهایی در دو مسیر متناوب بین تبائین و مرفین می باشد دخیل می باشند. آنزیم کدئینون ردوکتاز، واکنش احیاء وابسته به nadph کدئینون به کدئین را نیز کاتالیز می کند. در این پروژه، ژن های کدکننده این آنزیم ها با استفاده از آغازگرهای طراحی شده بر اساس توالی ژن ها در بانکهای اطلاعاتی برای شقایق الی فرا جداسازی گردید. rnaی کل جهت سنتز cdna استخراج و cdna کدکننده آنزیمهای sat و cor با استفاده از رونویسی معکوس mrna استخراج شده از گیاهان 6 هفته ای تولید گردید. این ژن ها ابتدا در ناقل همسانه سازی ptz57rit مستقر گردیدند. پلاسمیدهای نوترکیب جهت تراریختی سویه dh5? باکتری e. coli به کار گرفته شد. پس از انتخاب همسانه های مثبت در محیط انتخابی، استخراج پلاسمیدها انجام گردید. پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از روش هضم آنزیمی و pcr تأیید گردیدند. dnaی بازیابی شده از ژل آگارز 1% جهت همسانه سازی بعدی در پلاسمید بیانی pbi121 بین جایگاه های برشیbamhi وsaci به منظور بیان ژن ها تحت کنترل پیش برنده camv 35s مورد استفاده قرار گرفت. پلاسمید نوترکیب در سویه dh5? باکتری e. coli منتقل شد. نتایج این همسانه سازی با استفاده از روشهای مختلف ملکولی نظیر هضم آنزیمی و pcr تأیید گردید. سازه های ساخته شده جهت تراریخت سویه c58 باکتری آگروباکتریوم تومفسینس مورد استفاده قرار گرفت. از روش آگرواینفیلتراسیون جهت بیان موقت ژن های sat و cor در برگهای گیاهان شقایق الی فرا استفاده گردید. این سازه ها به منظور بیان دایم در ریزنمونه های هیپوکوتیلی گیاهان شقایق الی فرا استفاده شد. بیان ژن ها با استفاده از آنالیزهای بیوشیمیایی کروماتوگرافی لایه نازک tlc و کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (hplc) عصاره برگ و مولکولی pcr تأیید گردید. نتایج ارزیابی نشان داد که مرفین، کدئین، پاپاورین و نوسکاپین تنها در برگ های گیاهان تراریخت تولید می گردد.