تولید گیاه توتون مقاوم به ویروس PVX با استفاده از مکانیسم RNA Silencing

چکیده یکی از مهم­ترین ویروس­های بیماری­زای خانواده سولاناسه ویروس (PVX)Potato X virus  می­باشد که سبب ایجاد لکه­های موزاییک سیستمیک در توتون (Nicotiana tabacum L.) و خسارت اقتصادی به آن می­شود. بهترین روش مدیریت این بیماری استفاده از ارقام مقاوم توتون است. در این تحقیق جهت ایجاد گیاهان توتون مقاوم به PVX ابتدا سازه سنجاق­سری قطعه­ای 400 نوکلوتیدی از ژن P25 این ویروس که ممانعت کننده از RNA Silencing در گیاه است، ساخته شد. برای این کار قطعه ژن P25 به روش PCR با آغازگرهای اختصاصی تکثیر و در دو مرحله، در دو جهت سنس و آنتی­سنس در ناقل pFGC5941 همسانه سازی شد. در مرحله بعد، سازه RNAi از روی این ناقل نوترکیب به واسطه­ آگروباکتریوم، به ریزنمونه­های (قطعات برگ) گیاهان توتون رقم سامسون انتقال یافت و گیاهان تراریخته با گزینش روی محیط کشت حاوی بستا بدست آمده که پس از تکثیر مورد بررسی­های فنوتیپی و مولکولی قرار گرفتند. بررسی مولکولی با PCR روی DNA گیاهان، وجود تراژن را تایید کرد. نسل بعدی گیاهان تراریخته در گلخانه به روش مکانیکی با PVX تلقیح شدند. نتایج ELISA با آنتی­بادی اختصاصی پروتئین پوششیPVX مقاومت سه لاین تراریخته را نشان داد. تایید مولکولی این سه لاین مقاوم توتون به PVX با استفاده از RT-PCR روی RNA استخراج شده از گیاهان به­کمک آغازگرهای CP ویروس انجام شد و ویروس در گیاهان تراریخت ردیابی نگردید. نتیجه این تحقیق منجر به تولید سه لاین مستقل توتون مقاوم به PVX شد که بررسی مقاومت آنها در شرایط مزرعه در حال انجام می­باشد.