یکی از مشکلات استفاده از باکتری اشرشیاکلی برای تولید انبوه پروتئین نوترکیب، ترشح استات در محیط کشت است که سبب کاهش طول عمر باکتری و به دنبال آن کاهش بیان پروتئین نوترکیب می شود. در این رساله ما از فناوری rnaی آنتی سنس به عنوان ابزاری سودمند در مهندسی متابولیک برای مهار جزئی بیان ژن های مربوط به دو آنزیم اصلی مسیر استات، یعنی فسفوترانس استیلاز (pta) و استات کیناز (ack)، استفاده کردیم. یک پلاسمید نوترکیب که حاوی ژن های آنتی سنسی است که هر دو ژن acka و pta را مورد هدف قرار می دهد، ساخته شد و اثرات آن بر مسیر استات و تولید پروتئین نوترکیب در باکتری اشرشیاکلی bl21 (de3) دارای کاست آنتی سنس و فاقد آن مورد مطالعه و مقایسه قرار گرفت. اینترفرون بتای نوترکیب به عنوان پروتئین مرجع انتخاب شده و بیان ژن های آنتی سنس با استفاده از پروموتر قوی t7 و پروموتر طبیعی ژن acka که پروموتری ضعیف می باشد، کنترل شد. در طی این پژوهش ما دریافتیم که کاست آنتی سنس، تحت بیان پروموتر طبیعی ژن acka، سطح mrnaی ژن های مورد هدف را به طور جزئی کاهش داده و باعث کاهش ترشح استات در محیط کشت می شود. آنچه مورد توجه می باشد این است که در این حالت، با این که میزان کاهش استات چشمگیر نبود، میزان بیان اینترفرون بتا در باکتری دارای کاست نسبت به گونه ی کنترل 2/4-6/3 برابر افزایش نشان می داد. در صورتی که وقتی میزان استات تحت تاثیر پروموتر قوی t7 کاهش قابل توجه از خود نشان می داد، باکتری ها سریعتر دچار مرگ می شدند. این موضوع نشان می دهد که نسبت به آنچه در گزارش های قبلی وجود دارد، مسیر استات دارای اثرات حیاتی تری در فیزیولوژی سلولی می باشد. وقتی آزمایش ها تحت تنظیم پروموتر طبیعی ژن acka در محیط کشت با مقیاس بالاتر انجام شد، افزایش رشد و طول عمر باکتری هم بیشتر شده و این نتایج بیانگر این است که، این فناوری می تواند با موفقیت در مقیاس صنعتی تولید پروتئین نوترکیب در باکتری اشرشیاکلی هم به کار گرفته و ارزیابی شود.

فوتوپروتئین اکورین جدا شده از ژله فیش اکوریا ویکتوریا، فوتوپروتئین حساس به کلسیم است که از اپوپروتئین اپواکورین و گروه پروستاتیک کوالنترازین تشکیل شده که دراثر اتصال با کلسیم نور نشر می کند. این پروتئین مونومری شامل 4 موتیف ef hand است که 3 دومین آن می تواند به کلسیم متصل شود. اکورین به طور گسترده ای به عنوان شناساگر داخل سلولی کلسیم عمل می کند علاوه براین، فوتوپروتئین ملکول گزارشگر ارزشمند است چراکه در حضور کلسیم قدرت شناسایی درسطح اتومول را دارد. از طرف دیگر نقش مهمی در آبشار انتقال پیام عصبی از جمله رهاسازی نوروترانسمیتر، فعال سازی آنزیم دارد. دراین جا، ما 2 موتاسیون نقطه ای k30t)و (n28d و دو موتاسیون ترکیبی [nnk (n26d, n28d, k30t)] و nhn (n26d, h27g, n28d)] را در ناحیه ef hand ? طراحی کردیم. موتاسیون ها در این ناحیه از طریق روش موتاسیون هدایت شده کوایک چنج انجام شد و جهت بررسی حساسیت به کلسیم، اپواکورین با دنباله هیستیدین در e.coli بیان شد و نتایج نشان داد دو تک موتاسیون k30t,n28d برخلاف دو موتاسیون ترکیبی n26e , h27g , n28e (nhn) و n26d , n28d k30t (nnk)حساسیت بالاتری به کلسیم دارد.

هلیکوباکتر پیلوری بعنوان شایع ترین عامل باکتریایی مسبب گاستریت مزمن محسوب می گردد که با بیماری های زخم معده و سرطان معده در ارتباط است. پروتئین caga هلیکوباکتر پیلوری اولین انکوپروتئین باکتریایی شناخته شده دخیل در ارتباط با سرطان در انسان می باشد. caga از طریق سیستم ترشحی تیپ iv وارد سلول های اپیتلیال معده شده، در نزدیکی غشای سلولی قرار گرفته و در آن جا توسط کینازهای سلولی تحت تیروزین فسفوریلاسیون قرار می گیرد. caga دارای تنوع ساختاری در ناحیه c - ترمینال خود می باشد که از طریق این ناحیه با پروتئین های میزبانی متعددی واکنش می دهد. این پلی مورفیسم به علت وجود ترکیب های متفاوت چهار موتیف epiya می باشد که در مجموع c – ترمینال این پروتئین را تشکیل می دهند. تنوع ساختاری پروتئین caga تاثیر قابل ملاحظه ای بر فعالیت پاتوفیزیولوژی این انکوپروتئین دارا می باشد. هدف از مطالعه حاضر، درک تاثیر تیپهای مختلف caga بر اساس موتیفهای epiya، بر مسیرهای سیگنالینگ شناخته شده در ایجاد سرطان معده می باشد. از میان 71 بیمار، 60 نفر دارای گاستریت مزمن، 7 نفر duodenitis، 2 نفر intestinal metaplasia، 1 نفر هایپرپلازیا و 1 نفر سرطان معده بودند. تمامی جدایه ها از نظر خصوصیات ژنی caga ، vaca ، icea و baba تحت ژنوتیپینگ قرار گرفتند که فراوانی ژنهای caga، vacas1، vacas2، vacam1، vacam2، icea1، icea2، icea1+icea2 و baba2 بترتیب 62%، 9/78%، 7/19%، 1/21%، 9/78%، 5/15%، 5/22%، 8/40% و 8/95% بود. در ژنوتیپ های ترکیبی تنها ترکیپ ژنوتیپی caga+/vacas1m1/icea2/baba ارتباط معناداری را با بیماری گاستریت مزمن شدید فعال نشان داد( p=0.025). در بین 44 ایزوله caga مثبت، با غربالگری سویه های تحت بررسی از نظر تنوع موتیف های epiya ، موتیفهای epiya abc (30 ایزوله)، abcc (4 ایزوله)، abccc (1 ایزوله)، تیپهای میکس (6 ایزوله) و تیپ جدید a-b/c (3 ایزوله) مشاهده شد. بررسی این ترادف ها همچنین حضور موتیف های اسید آمینه ای شبیه به epiya یعنی epiyt و qpiyp را نشان داد. به منظور بررسی اثرات تنوعات پروتئینی ناحیه کربوکسی caga در بیان ژن های دخیل در مسیرهای سرطانزایی بافت معده، دو واریانت ژنی ناحیه epiya abc) و (abccc در وکتور بیانی یوکاریوتی pegfp-n1 که حاوی فیوژن gfp می باشد کلون شد. در فاز دوم پس از کشت دادن سل لاین ags، ناقل بیانی یوکاریوتی حامل ژن caga به داخل کشت سلولی سرطان معده ترانسفکت شد. برای تایید بیان caga در کشت سلولی سرطان معده، از دو روش ایمونوبلاتینگ و میکروسکوپ فلورسنس استفاده شد. در فاز سوم rna سلولهای ترانسفکت شده به کمک کیت استخراج شده و سپس از روی rna به دست آمده cdna سنتز شد. سپس 44 ژن کلیدی شناخته شده در سرطان معده در سطح نسخه برداری به کمک روش real-time pcr بررسی شدند. در نهایت جابجایی کمپلکس های غشایی بتا کتنین مرتبط با سیگنالینگ بیان ژن های مرتبط با سرطانزایی بروش ایمونوسیتوشیمی بررسی شد. بر اساس بررسی نتایج real-time pcr نشان داد که در 12 گروه ژنی طبق بندی شده، در 11 گروه تیپ abccc به میزان بیشتری از تیپ abc سبب تغییر در میزان رونویسی از ژنهای تحت مطالعه شده است، که این تفاوت در مورد ژنهای مرتبط با سرطانزایی تفاوت معنا داری را نشان داد. نتیجه بررسی جابجایی کمپلکس های غشایی نشان داد که واریانت caga حاوی موتیف abccc این توانایی را به شکل واضحتری نسبت به موتیف abc از خود نشان داده بود، که این مطلب می تواند دلیل دیگری بر قدرت بیشتر سرطانزایی تپپ abccc در مقابل تیپ abc می باشد. نتایج تحقیق ما بدون شک موید این مطلب می باشد که تیپ caga می تواند تعیین کننده ریسک افزایش یافته سرطان معده باشد، بطوریکه شانس ابتلا به سرطان معده در فردی که آلوده به هلیکوباکتر پیلوری با caga از تیپ abccc باشد نسبت به فردی که توسط هلیکوباکتر پیلوری با caga از تیپ abc آلوده شده باشد ، بسیار بیشتر خواهد بود.

با توجه به اهمیت جستجو و جداسازی سویه های مولد آنتی بیوتیک ونظر به اهمیت آنتی بیوتیک اریترومایسین ، در این تحقیق به جستجوی سویه های مولد این آنتی بیوتیک در خاکهای مناطق مختلف ایران اعم از خاکهای کویری ، جنگلی و کوهستانی پرداخته شد. برای دستیابی به این مقصود ، درابتدا انتخاب محیط کشت مناسب برای جداسازی سویه های اکتینومایست مولد اریترومایسین انجام پذیرفت. نتایج آزمایشها نشان داد که از بین محیطهای کشت گلیسرول کازئین آگار ، گلیسرول آرژینین آگار، ‏‎czapack‎‏ آگار ، نشاسته آگار، گلوکز عصاره مخمرآگار، محیط کشت گلیسرول - آرژینین آگار برای جداسازی اکتینومایست های مولد اریترومایسین ، مناسب تشخیص داده شد. و نیز به عنوان عامل انتخابی از آنتی بیوتیک اریترومایسین در محیط کشت استفاده شد. پس از آن اقدام به نمونه برداری از خاک های مناطق مختلف کشور گردید.توضیحات بیشتر را می توان از پایان نامه استخراج نمود.