سیب درختی (malus domestica borkh) عضوی از خانواده گلسرخیان (rosaceae) بوده و سازگار با آب و هوای خنک می باشد. ویروس ساقه شیاری سیبapple stem grooving virus (asgv) عضوتیپ جنس capillovirus، ویروس ساقه آبله ای سیب apple stem pitting virus (aspv) عضو تیپ جنس foveavirus و ویروس لکه سبزرد برگ سیب apple chlorotic leaf spot virus (aclsv) عضو تیپ جنس trichovirus متعلق به خانواده betaflexiviridae، از مهمترین ویروس های بیماری زای سیب محسوب می شوند. آلودگی این ویروس ها در سیب عمدتا فاقد علایم است و باعث کاهش 60 درصدی محصول به ویژه در آلودگی های مخلوط می شوند. توسعه روش های تشخیص سریع، دقیق و حساس برای اتخاذ روش های مدیریتی صحیح به منظور کنترل بیماری های ویروسی ضروری به نظر می رسد. هدف از این تحقیق بهینه سازی یک روش multiplex rt-pcrبرای تشخیص همزمان asgv، aspv و aclsv می باشد. به این منظور نمونه برداری از باغات سیب استان های اصفهان، لرستان، چهارمحال و بختیاری و مرکزی در فصول مختلف سال های 91 و 92 انجام شد. از برگ ها و شکوفه های درختان سیب جهت استخراج rna total استفاده شد و از آن به عنوان الگو در آزمون rt-pcr با استفاده از جفت آغازگر های اختصاصی asgv-f/asgv-r برای asgv، aspa/aspc برای aspv و a52/a53 برای aclsv استفاده شد. آلودگی نمونه ها به ویروس های asgv، aspv و aclsv در آزمون rt-pcr به ترتیب با تکثیر قطعات bp713، bp264 و bp 358 تایید شد. تمامی باند های تکثیر شده تعیین توالی شدند و نتایج حاصل از blast نشان دهنده ویروسی بودن آن ها بود. تشخیص همزمان asgv، aspv و aclsv ابتدا با استفاده از duplex rt-pcr به صورت ترکیب دوتایی جفت آغازگر های اختصاصی ویروس ها و سپس با استفاده از multiplex rt-pcr با جفت آغازگرهای اختصاصی هر سه ویروس انجام گردید. نتایج حاصل نشان دهنده کارایی multiplex rt-pcr در تشخیص همزمان asgv، aspv و aclsv بود. صدوده نمونه جمع آوری شده با استفاده از آزمون multiplex rt-pcr بررسی شدند. نتایج حاصل نشان داد 70 نمونه به ویروس asgv، 53 نمونه به ویروس aspv و 35 نمونه به ویروس aclsv آلوده بودند. میزان آلودگی مخلوط در بین نمونه های جمع آوری شده 37%، 24%، 19% و 16% به ترتیب برای aspv+asgv، asgv+aclsv، aspv+aclsv و asgv+aspv+aclsv برآورد گردید. بر اساس دانش ما، این اولین گزارش در مورد استفاده از روش multiplex rt-pcr در تشخیص همزمان ویروس های سیب در ایران می باشد. نتایج این تحقیق نشان داد که روش multiplex rt-pcr روشی حساس، دقیق، سریع، مقرون به صرفه و قابل اطمینان برای ردیابی همزمان ویروس های مهم درختان سیب می باشد.