فاکتور رشد اپیدرمال انسانی (hegf) پلی پپتید مونومری و کوچک است که توسط سلول های بافت های مختلفی در بدن انسان تولید می شود. hegf علاوه بر رشد سلول های اپیدرمال، بر روی سلول های مختلفی نیز تأثیر می گذارد و مصارف بسیار زیادی در صنایع مختلف پزشکی، دارویی، آرایشی و بهداشتی دارد. در حال حاضر این فاکتور رشد توسط محققین و شرکت های مختلفی تولید و مصرف می گردد. بکارگیری فناوری dna نوترکیب و استفاده از روش های جدید و کارآمد کمک قابل ملاحظه ای در دست یابی به مقادیر نسبتاً مناسب کرده است ولی تا به حال بازدهی بالایی از میزان تولید hegf نوترکیب پری پلاسمی گزارش نشده است. به دلیل بالا بودن سرعت بیان پروتئین ها نوترکیب در سیستم های بیانی مانند اشریشیا کلی، پروتئین های نوترکیب به سرعت در سیتوپلاسم سلول تجمع یافته و تولید اجسام نامحلول را می دهند که سبب القاء پاسخ های میزبان، عدم ترشح به پری پلاسم باکتری و حتی ممکن است موجب لیز باکتری شود. بنابراین برای دستیابی به بازدهی بالای پروتئین نوترکیب ترشحی و فعال به لحاظ عملکرد زیستی، بهینه سازی شرایط تولید اهمیت بسزایی دارد. در این تحقیق اثر دما، غلظت گلوکز اولیه در محیط کشت lb و غلظت آرژینین برای افزایش تولید پری پلاسمیک پروتئین نوترکیب hegf در کشت غیرمداوم اشریشیا کلی بررسی شد. تحت شرایط بهینه: رشد در دمای 30 درجه سانتی گراد، القاء بیان توسط 2/0 میلی مولار iptg، استفاده از 20 گرم بر لیتر گلوکز، و افزودن 3/0 مولار ال-آرژینین مقدار ترشح پروتئین نوترکیب به پری پلاسم به 25 درصد پروتئین کل سلول رسید. میزان فاکتور رشد اپیدرمال انسانی از پری پلاسم باکتری توسط روش شوک اسمزی اصلاح شده در شرایط بهینه 920 میلی گرم بر لیتر بدست آمده است که از بالاترین مقادیری است که تاکنون گزارش شده است.

فاکتور رشد فیبروبلاستی-10 انسانی (hfgf-10) گلیکو پروتئین مونومری است که توسط سلولهای فیبروبلاستی در دوره ی جنینی تولید و موجب رشد و تمایز بافت ریه و تشکیل جوانه های دست و پا و رشد جهت دار آن به سمت خارج می شود و در بزرگسالی در ترمیم سلولهای آسیب دیده ی ریه و زخمها نقش ایفاء می کند. فاکتور رشد مزبور،تولید شده، بیشتر و صرفا در آزمایشگاه ها برای تولید بافت ریه استفاده می شود و نوع دارویی آن با نام تجاری رپی فرمین درحال گذراندن مراحل آزمایشهای بالینی بر روی حیوانات و انسان می باشد. در کشور ما نیز به دلیل استقبال از فنون مهندسی بافت و تولید بافت ریه در آزمایشگاه به صورت کلی یا جزیی، نیاز مبرم به تولید این فاکتور رشد در داخل کشور وجود داشته است، به همین دلیل ژن سنتتیک سفارش داده شده جهت همسانه سازی، بیان و تولید آزمایشگاهی آن استفاده شد. در این پژوهش، همسانه سازی ژن موردنظر در حامل بیانی مناسب، انتقال آن به میزبان بیانی باکتری اشریشیا کلی به دلیل سادگی روش های دستکاری ژنتیکی، سرعت رشد بالا، قابلیت دست یابی به تراکم سلولی بالا، نیازمندی های غذایی ساده، توالی ژنوم کاملا مشخص و مسیرهای متابولیکی کاملا شناخته شده و تولید داخل سیتوپلاسمی جهت دستیابی به حداکثر میزان بیان مورد توجه قرار گرفت.

اشرشیاکلی انتروتوکسیژنیک علت اصلی اسهال درکشورهای در حال توسعه است. دو شاخص ویرولانس etec عبارت است از: کلونیزاسیون در روده ی کوچک و تولید انتروتوکسین ها. اتصال با واسطه ی آنتی-ژن های فاکتورهای کلونیزاسیون انجام می شود و پس از اتصال، باکتری یک یا چند انتروتوکسین تولید می کند و نتیجه ی این وقایع ترشح مایعات به صورت اسهال است. فیمبریه ی cs3 یکی از شایع ترین آنتی ژن های فیمبریال یافت شده در ایزوله های کلینیکی است. کلاستر ژنی مسئول بیوسنتز cs3 شامل ژن های csta-csth است. ثابت شده است که csth کدکننده ی زیرواحد اصلی فیمبریه است و نقش اساسی در اتصال باکتری به سلول های اپی تلیال روده ی کوچک دارد. این زیرواحد یک کاندید فرضی در توسعه ی واکسن محسوب می شود. بر اساس مطالعات اپیدمیولوژی و کلینیکی، بهترین کاندید واکسن برای etec، واکسنی است که شامل فاکتورهای کلونیزاسیون و هم چنین انتروتوکسین باشد. زیرواحد b توکسین حساس به حرارت که توسط بیشتر ایزوله های etec تولید می شود، در مقایسه با زیرواحد a این توکسین خصوصیات ایمنولوژیک بیشتری دارد. در مطالعه ی حاضر، ما یک پروتئین کایمر (csth-ltb) طراحی نموده ایم که می تواند به عنوان یک واکسن کاندید بر علیه این پاتوژن در نظر گرفته شود؛ به طوری که شامل هر دو عامل ویرولانس etec باشد. توالی ژن های کدکننده ی csth و eltb از بانک ژن به دست آمد و توسط نرم افزارهای بیوانفورماتیکی اپتیمایز شد. توالی ژن کایمر با اتصال این دو توسط لینکری مناسب ساخته شد. ژن سنتتیک که در وکتور puc57 سنتز شد، در وکتور pet28a زیرهمسانه سازی گردید. زیرهمسانه سازی با آنالیز برش آنزیم های محدودکننده تایید شد. بیان پروتئین نوترکیب در باکتری e.coli bl21de3 انجام و توسط وسترن بلات با آنتی بادی ضد his tag تایید شد. پروتئین های تخلیص شده برای تولید آنتی بادی به موش های سوری نژاد balb/c و خرگوش تزریق شد. تست الایزا با استفاده از سرم حیوان برای تعیین تولید آنتی بادی انجام گرفت. کارآمدی آنتی بادی توسط سنجش لوپ ایلئال خرگوش و اتصال به سلول های caco-2 تایید شد. آنالیزهای ایمنولوژیک تولید تیترهای بالای آنتی بادی اختصاصی را در حیوانات ایمن نشان داد. آنتی بادی ضد پروتئین کایمر، توانست به فیمبریه ی cs3 متصل و مانع از اتصال باکتری گردد. نتایج نشان می دهد پروتئین کایمر نوترکیب می تواند به عنوان یکی از مهم ترین اجزای واکسن علیه etec در نظر گرفته شود.

اشرشیاکلی انتروتوکسیژنیک (etec) علت اصلی اسهال درکودکان زیر 5 سال در کشورهای در حال توسعه و همچنین عامل مهم اسهال مسافرتی می باشد. بنا براین طراحی و تولید واکسن بر علیه این بیماری از اهداف سازمان جهانی بهداشت می‏باشد. انتروتوکسین و فاکتورهای کلونیزاسیون دونوع از فاکتور‏های اصلی ویرولانس etec هستند که فاکتورهای کلونیزاسیون، برای اتصال به سلول‏های اپیتلیال روده ضروری‏اند. از شایعترین فاکتورهای کلونیزاسیون می‏توان به cs6 اشاره نمود. cs6 از دو زیر واحد ساختاری cssa وcssb تشکیل شده است که در اتصال باکتری به سلول های روده نقشی اساسی دارند. از جهتی، نیمی از اشرشیاکلی‏های انتروتوکسیژنیک بیان کننده انتروتوکسین حساس به حرارت(lt) هستند. طراحی و تولید واکسن های بر علیهetec بر اساس دو راهکار جلوگیری از اتصال به سلولهای روده و جلوگیری از فعالیت توکسین است. بنابراین در این مطالعه یک پروتئین نوترکیب متشکل از زیر واحد های cssa وcssb و blt به عنوان کاندیدای واکسن طراحی شد. اطلاعات این 3 ژن از بانک ژن استخراج و به وسیله لینکر، یک ساختار کایمر سه تایی ایجاد شد. توالی کد کننده با استفاده از ترجیح کدونی در ecoli طراحی شد. سپس در وکتور puc57سنتز ودر وکتور بیانی pet28a زیرهمسانه سازی و بیان شد. صحت پروتئین نوترکیب به وسیله آزمایش وسترن بلات تایید و پروتئین با ستون کروماتوگرافی تمایلی تخلیص گشت. مطالعه ایمنی زایی پروتئین کایمر تخلیص شده در موش و خرگوش انجام شد. نتایج تست الایزا با سرم موش و خرگوش برای تعیین تولید آنتی بادی نشان دهنده تولید تیتر بالای آنتی بادی بود. همچنین پیش انکوبه کردن سلولهای روده ای caco-2 با سرم حیوانات مدل ایمن شده، اتصال باکتری را به این سلول ها تا حد قابل توجهی کاهش داد. کارایی آنتی بادی بر علیه lt نیز با تست سنجش لوپ ایلئال خرگوش تایید گشت.با توجه به نتایج به دست آمده، پروتئین کایمر نوترکیب می‏تواند به عنوان یک پروتئین ایمونوژن از اجزای مهم واکسن بر علیه etec باشد.

عفونت های اسهالی یکی از شایعترین بیماری ها در سراسر جهان هستند.دو جنس shigella و escherichia اعضای مهم خانواده انتروباکتریاسه ها ( enterobacteriaceae) و عامل اصلی اسهال های عفونی می باشند. شیگلا از طریق تهاجم به سلول های اپی تلیال روده باعث ایجاد اسهال وشیگلوزیس می شوند.یکی از کلیدی ترین پروتئین هایی که در تهاجم نقش دارد ipac است. باکتری های دیگری از جمله etecو ehecاز جمله عوامل عمده در ایجاد اسهال هستند.عامل بیماریزائی اصلی در etec ، cfa/iاست که از دو زیر واحد cfab و cfaeتشکیل شده است. در باکتری ehec، اولین مرحله برای عفونت زایی،اتصال پروتئینی به نام intimin به لایه اپی تلیال میباشد که توسط ژن eae کد می شود. بنابراین با تولید واکسنی شامل این سه پروتئین شاید بتوان از اتصال سه باکتری مذکور ومتعاقبا ایجاد اسهال جلوگیری کرد. هدف از این تحقیق طراحی و تولید پروتئین کایمر(cii) از سه ژن cfab, eae و ipac که بتواند برعلیه این سه باکتری ایمنی ایجاد کند. ژن کایمر ;cii که شامل نواحی ایمونوژیک سه پروتئین فوق بود طراحی و بهینه سازی کدونی شد. آنالیزهای بیوانفورماتیکی و ایمونوانفورتیکی بر روی ژن نوترکیب کایمر انجام شد. بعد از سنتز، این ژن در e. coli کلون و بیان شد. به منظور بررسی ایمنی زایی cii، موش، خوکچه هندی ورده سلولی caco-2 به عنوان مدل برای چالش باکتری های ehec،shigella وetec به ترتیب، انتخاب شدند. نتایج حاکی از این بود که پروتئین cii پاسخ ایمنی قوی القا میکند. بنابراین این پروتئین کایمر می تواند به عنوان یک کاندید واکسن بر علیه طیف گسترده ای از عفونت های اسهالی مورد مطالعه بیشتری قرار گیرد.

یکی از شایعترین عوامل ایجاد کننده بیماری اسهال که هر ساله سبب مرگ تعداد زیادی در جهان می شود باکتری های اشریشیا کلی انتروتوکسیژنیک (etec) ، شیگلا فلکسنری و اشریشیا کلی انتروهموراژیک (ehec ) می باشند. امکان به وجود آمدن ایمنی حفاظتی برعلیه این بیماری وجود دارد، لذا طراحی و ساخت واکسن علیه این بیماری از اهداف سازمان های بهداشتی نظیرwho می باشد.etec گروه متنوعی از پاتوژن ها هستند که توانایی تولید و حمل انتروتوکسین های حساس و مقاوم به حرارت را بعد از کلونیزاسیون در روده کوچک داردند . کلونیزاسیون ویژگی بیماری زایی ضروری برای etec می باشد. چسبندگی به واسطه فاکتور های کلونیزاسیون (cf ) صورت می گیرد . در این بین آنتی ژن cfa/i ، شایع ترین فاکتور ویرولانس جدا شده از etec است . cfa/i واجد یک ساختار ساقه مانند است که که شامل زیر واحد اصلی و عمده cfab و زیر واحد فرعیcfae است . زیر واحد cfab جزو پروتئین های متصل شونده به گلیکواسفنگولیپید ها می باشد ، به نظر می رسد این زیر واحد نقش حیاتی و مهمی را در اتصال باکتری به سلول های اپیتلیال روده کوچک بازی می کند و کاندید مناسبی برای تولید واکسن است . دراشریشیاکلی سویه o157:h7 پروتئین های intimin، tir و espa مهمترین فاکتورهای بیماریزایی این باکتری به حساب می آیند که توسط ژن های حاضر در جزیره پاتوژنسیته lee تولید می شوند. پروتئین espa بخش اصلی از پروتئین هایی است که در ساخت کانال ارتباطی در سیستم ترشحی نوع iii نقش داشته و مانند یک رابط سبب انتقال پروتئین tir به سلول میزبان می شود ( در اینجا انسان) و در نهایت پروتئین intimin با اتصال به tir ،اتصال باکتری به سلول میزبان را سبب می شود. این اتصال باعث ایجاد ضایعه تخریب دیواره سلول یا ae میزبان می گردد . ژن eae کد کننده پروتئین intimin است که این پروتئین برای کلونیزاسیون در موکوس روده و ایجاد ضایعه ae ضروری می باشد . از طرف دیگر شیگلا فلکسنری نیز برای تهاجم سلولی نیازمند کد کردن ژن هایی که در پلاسمید های تهاجمی باکتری ، است .اپرون mix-spa پروتئین های سیستم ترشحی تیپ iii را کد می کند که نقش ترانسفر کننده و افکتور را در ورود با کتری به داخل غشا و سیتوپلاسم سلول میزبان دارد . پروتئین های ipaa-d در این پروسه نقش مهمی را ایفا می کنند . در بین پروتئین هایی که به وسیله این سیستم ترشح می شوند ipac به عنوان تحریک کننده پلی مریزاسیون اکتین و شکل گیری فیلوپودا و لامیناپودا می باشد که از مهم ترین مراحل در ورود باکتری می باشد . در این تحقیق ما ژنهای ipac,intimin,cfab را در وکتور های pet-28a,pet-32a کلون کردیم .بعد از بیان و تخلیص پروتئین های نوترکیب ایجاد شده ایمنی ایجاد شده به وسیله آنها در موش و خوکچه هندی به عنوان یک واکسن trivalent بررسی شد . نتایج نشان داد که این واکسن کارایی بالایی در تحریک سیستم ایمنی همورال داشته و می تواند به عنوان یک کاندید واکسن مناسب مطرح شود . کلید واژه : اشریشیا کلی انتروهموراژیک ، اشریشیا کلی انتروتوکسیژنیک ، شیگلا فلکسنری ، واکسن trivalent ، ژن های ipac,intimin,cfab

آنژیوژنز فرایندی است که در طی آن رگ های خونی جدید در بدن تشکیل می شود. تشکیل رگ های جدید در یک تومور سرطانی باعث می شود مواد غذایی و اکسیژن بیشتری به سلول های تومور رسیده و تومور از حالت توده ی سلول های جهش یافته و بی ضرر تبدیل به یک تومور بدخیم شود. این تومور می تواند به بافت های دیگر حمله نموده و منجر به متاستاز شود. یکی از مهم ترین عوامل آنژیوژنز در بدن فاکتور رشد اندوتلیال رگی (vegf) می باشد. مهار عملکرد vegf باعث توقف آنژیوژنز و متاستاز تومورها می گردد. آنتی بادی های زنجیره سنگین شتری نوع خاصی از آنتی بادی بوده که در شترهای خانواده camelidae یافت می شوند. ناحیه اتصال به آنتی ژن این آنتی بادی ها تحت عنوان vhh یا نانوبادی، دارای خصوصیات منحصر به فردی از جمله پایداری بالا در برابر گرما، مواد کائوتروپیک و ph بوده و به دلیل داشتن اندازه کوچک قابلیت نفوذ موثرتری به بافت ها را دارند. این خصوصیت باعث می شود بتوانند اپی توپ های پنهان یا غیر عادی را شناسایی کنند. تکنیک نمایش فاژی تکنیک پرقدرتی برای مهندسی نمودن پپتیدها و پروتئین ها می باشد. این تکنیک قابلیت نمایش کتابخانه هایی با میلیون ها و حتی میلیاردها پپتید یا پروتئین مختلف را دارد. هدف از پروژه حاضر تولید نانوبادی های مشتق از آنتی بادی زنجیره سنگین شتری بر علیه فاکتور رشد اندوتلیال رگی (vegf-a) با استفاده از تکنیک نمایش فاژی می باشد. برای این کار ناحیه اتصال به رسپتور vegf-a سنتز شده در وکتور pet28a کلون گردید. پس ازبیان آن، پروتئین حاصل به عنوان ایمونوژن در پنج نوبت به شتر تزریق شد. پس از ایمن شدن شترها و کنترل ایمنی با آزمایش الایزا، لنفوسیت ها از خون محیطی استخراج شده و تخلیص rna آن انجام شد. در مرحله بعد با استفاده از rt-pcr، cdna ساخته شد. طی دو مرحله pcr (nested pcr) قطعات کد کننده vhh سنتز شدند. در pcr اولیه باندهای 600، 700 و 900 جفت بازی و در pcr ثانویه دو باند 400 و 500 جفت بازی در ژل مشاهده شد. قطعه 400 جفت بازی حاصل ازpcr دوم (vhh) در وکتور فاژمیدی pcomb3x کلون گردید. قطعه و وکتور هر دو با آنزیم sfii برش داده شده بودند. این عمل برای ساخت کتابخانه فاژی انجام می شود.

باکتری اشریشیاکولی انتروتوکسیژنیک، یکی از عوامل شایع اسهال در بین کودکان است. فاکتورهای کلونیزاسیون و توکسین حساس به حرارت، مهمترین کاندیدای واکسن علیه etec می باشند. پروتئین های کایمریک دربردارنده اپی توپ ها و یا ادجوانها سبب افزایش احتمال بروز پاسخ ایمنی هومورال و یا سلولی می شود. فرض ما بر این بود که پروتئین کایمر دربردارنده فاکتورهای کلونیزاسیون شایع و زیر واحد ltb به عنوان کاندید واکسن خوراکی می تواند سبب محافظت در برابر اتصال باکتری و عملکرد توکسین گردد. به منظور دستیابی به رایجترین فاکتورهای کلونیزاسیون از سویه های ایرانی، فنوتیپ و ژنوتیپ سویه های etec جدا شده از کودکان ایرانی مشخص شد. بر اساس پروفایل سویه هایetec ، ژن کایمر کدکنندهcfab ، csth، cota وltb طراحی گردید. مدلسازی به منظور پیش بینی ساختار سوم پروتئین کایمر انجام گرفت. ژن l2c3 بهینه سازی کدونی شد و در وکتور بیانی e.coli، همسانه سازی گردید. پروتئین نوترکیب با روش امولسیون دو گانه در پلیمر plga انکپسوله و خصوصیات فیزکیوشیمایی نانوذره ها ارزیابی شد. ایمنوژنیسیتی خوراکی پروتئین کپسوله شده بررسی گردید. شیوع باکتری etec 11/7 درصد بود. بیشتر سویه های جدا شده دارای توکسین lt و st بودند. فاکتورهای کلونیزاسیون cfa/i، cs2، cs3 و cs5 در برخی از سویه ها شناسایی گردید. 2/97 درصد از اسیدهای آمینه پروتئین کایمریک مورد نظر در محدوده مجاز نمودار راماچاندران قرار داشتند. نانوذرات غیر تجمعی و دارای شکل نسبتاً کروی با میانگین اندازه 9/256 بودند. کارائی انکپسوله کردن پروتئین کایمر 4/1±96/81 درصد بود. وزن مولکولی و خاصیت آنتی ژنیسیتی پروتئین رها شده از نانوذرات تغییری نکرد. ایمنی سازی موشها از راه خوراکی سبب القای پاسخ آنتی بادی igg سرمی و iga مدفوعی شد. ایمن سازی سبب ایجاد محافظت در برابر اتصال باکتری etec به سلولهای caco-2 گردید. اثر توکسین بر میزان camp و تجمع مایع در لوپهای روده به واسطه ممانعت از اتصال سم به گیرنده gm1 مهار شد. این یافته ها نشان می دهد انتقال پروتئین l2c3 در نانوذرات plga سبب بروز پاسخ ایمنی عمومی و مخاطی شده و می تواند به منظور توسعه ی ترکیب چندگانه برای مقابله با etec مورد استفاده قرار گیرد.

اشرشیاکلی انتروتوکسیژنیک (etec) از علل اصلی اسهال در کشورهای در حال توسعه و نیز کودکان می باشد. از مهمترین فاکتورهای حدت etec می توان انتروتوکسین و فاکتورهای چسبندگی (cfa) را نام برد. cfa/i اولین و رایج ترین فاکتور چسبندگی است. این فیمبریه دارای هزاران کپی از زیر واحد cfab و یک یا چند کپی از زیر واحد فرعی چسبنده cfae می باشد که در اتصال ارگانیسم به سلول های روده نقشی اساسی دارند. خاصیت ایمنی زایی زیرواحد b انتروتوکسین حساس به حرارت(lt) در مطالعات زیادی به اثبات رسیده است. فاکتورهای کلونیزاسیون و توکسین حساس به حرارت، مهمترین کاندیدای واکسن علیه etec می باشند. بنابراین در این مطالعه پروتئین نوترکیب متشکل از cfae، cfab و blt به عنوان کاندیدای واکسن طراحی شد. توالی ژن های این 3 پروتئین از بانکncbi استخراج و به وسیله لینکر، یک توالی کایمر تریمر ایجاد شد. توالی کد کننده با استفاده از ترجیح کدونی در e.coli طراحی شد سپس روی ناقل بیانی pet28a+ کلون شد. پس از انتقال سازه نوترکیب به میزبان اشرشیاکلی سویه bl21de3، بیان پروتئین و بهینه سازی آن انجام شد. نتایج بیان با sds-page بررسی و پروتئین نوترکیب از طریق کروماتوگرافی میل ترکیبی با کمک ستون ni-nta تخلیص شد. مطالعه ایمنی زایی پروتئین کایمر تخلیص شده در موش سوری نژاد balb/c انجام شد. برای تعیین تولید آنتی بادی igg تست الایزا با سرم موش انجام شد که نتایج نشان دهنده تولید تیتر بالای آنتی بادی بود. پیش انکوبه کردن سلولهای روده ای ht29 با سرم موش های ایمن شده، اتصال باکتری را به این سلول ها تا حد قابل توجهی کاهش داد. با توجه به نتایج به دست آمده، پروتئین کایمر نوترکیب می‏تواند به عنوان یک پروتئین ایمونوژن از اجزای مهم واکسن بر علیه etec باشد.

جنس acinetobacter در خانواده moraxellaceae طبقه بندی می شود. در این جنس کوکوباسیل هایی شدیدا هوازی، گرم منفی، غیرمتحرک، اکسیداز منفی، کاتالاز مثبت و غیرتخمیری قرار می گیرند. بیش از 30 گونه ی ژنومی در این جنس شناسایی شده که از این بین 17 تای آن ها نام های شناخته شده و معتبری دارند.acinetobacter baumannii یک پاتوژن مهم است که هم اکنون بعنوان عامل عفونت های بیمارستانی مثل عفونت های جریان خون، پنومونی وابسته به دستگاه تهویه و عفونت های زخمی، بخصوص در بیماران بحرانی که در بخش مراقبت های ویژه (icu) بستری شده اند شناخته می شود. این باکتری برای ایجاد عفونت در میزبان پرسلولی نیاز به آهن دارد که به شدت به وسیله میزبان محدود می شود. در شرایط هوازی باکتری برای غلبه بر این مشکل، انواع لیگاندهای آهن با وزن ملکولی کم به نام سیدروفور تولید و به محیط خارج سلولی ترشح می کنند که با گرایش زیاد به آهن فریک متصل می شوند و تشکیل کمپلکس فریک- سیدروفور را می دهند.baua (baumannii acinetobactin utilization) با وزن ملکولی در طیف 88-75 کیلودالتون یکی از مهم ترین پروتئین های غشای خارجی این باکتری برای جذب آهن است. آنتی بادی مونوکلونال علیه پروتئین های غشای خارجی تنظیم شونده به وسیله آهن (iromps) مانع از جذب آهن توسط این پاتوژن شده و باکتریسیدال می باشد. در صورتی که بتوان مانع از جذب آهن توسط این باکتری شد، می توان میزبان را در برابر تهاجم این باکتری ایمن نمود. در این مطالعه تاثیر ایمنی زایی و نیز اختصاصیت و حساسیت پروتئین نوترکیب غشایی baua علیه باکتریacinetobacter baumannii مورد بررسی قرار می گیرد.به منظور تهیه پروتئین نوترکیب baua، پس از کشت باکتریacinetobacter baumannii ، ژنوم آن تخلیص شد. با کمک واکنش زنجیره پلی مراز ژن baua از اسینتوباکتر بومانی به طول 2083 جفت باز فراوان سازی و پس از ایجاد برش در دو انتهای آن بوسیله ی آنزیم های محدود کننده ی مناسب، روی ناقل بیانی pet28a کلون شد. پس از انتقال سازه نوترکیب به میزبان اشرشیاکلی bl21de3، بیان پروتئین مورد نظر توسط غلظت های مختلف ایزوپروپیل تیو بتا- دی گالاکتوزید (iptg) القاء و بهینه سازی آن انجام شد. نتایج بیان با sds-page بررسی و پروتئین نوترکیب از طریق کروماتوگرافی میل ترکیبی با کمک ستون ni-nta تخلیص شد. در نهایت پروتئین نوترکیب با وزن مولکولی 75 کیلودالتون به موش-های balb/c تزریق و پس از تکمیل دوره ایمن سازی، تیتر آنتی بادی با سنجش الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت.تزریق این پروتئین به موش های balb/c نشان دهنده توان بالای آن در تحریک سیستم ایمنی و تولید آنتی بادی است. تست الایزا نشان داد که آنتی بادی تولید شده در شناسایی پروتین اتصالی فریک انتروباکتین قدرت بالایی دارد و موش های ایمن در مواجهه با 1010 باکتری زنده از خود مقاومت نشان دادند. لذا می توان از این پروتئین به عنوان کاندیدی مناسب برای تهیه واکسن علیه acinetobacter baumannii استفاده کرد.

baua(baumannii acinetobactin utilization) با وزن مولکولی 88-77 کیلودالتون یکی از مهمترین پروتئین های غشا خارجی باکتری اسینتوباکتر بومانی برای جذب کمپلکس آهن-سیدروفور و تهیه آهن مورد نیاز باکتری برای رشد است. در این مطالعه مبتنی بر یافته های قبلی دکتر رسولی و همکاران اپی توپ های آنتی ژنیک این پروتئین (دو بخش کرک و لوپ) هر کدام به طور مجزا و همچنین در ترکیب با یکدیگر برای بررسی ایمنی زایی، اختصاصیت و حساسیت به صورت نوترکیب تولید و مورد بررسی قرار گرفتند.

دو جنس شیگلا و اشریشیا (etec و ehec) اعضای مهم خانواده انتروباکتریاسه ها و عامل اصلی اسهال های عفونی می باشند. شیگلا از طریق تهاجم به سلول های اپی تلیال روده باعث ایجاد اسهال خونی (شیگلوزیس) می شود. یکی از کلیدی ترین پروتئین هایی که در تهاجم باکتری نقش دارد پروتئین ipac است. عامل بیماریزائی اصلی در etec ، گروه آنتی ژنی cfa/i است که از دو زیر واحد cfab و cfae تشکیل شده است. در باکتری ehec، اولین مرحله برای عفونت زایی، اتصال پروتئینی به نام intimin به لایه اپی تلیال می باشد که توسط ژن eae کد می شود. بنابراین با طراحی ایمونوژنی شامل سه پروتئین ipac، cfab و intimin شاید بتوان از اتصال سه باکتری مذکور ومتعاقبا ایجاد اسهال جلوگیری کرد. از آنجایی که این باکتری ها در مخاط روده کلونیزه می شوند، ایمن سازی مخاطی نقش مهمتری را ایفا می کند. نانوژل ها به عنوان یکی از بستر های مناسب برای انکپسوله کردن مولکول های زیستی مطرح می باشند و پلیمر کیتوسان از مناسب ترین پلیمر ها برای ساخت این حامل های مولکول های زیستی است. بسته بندی داروها در حامل های خاص شامل نانوژل ها علاوه بر حفاظت آنها در برابر عوامل محیطی و افزایش فعالیت زیستی آنها در فراهم کردن غلظت های مناسب از دارو در محیط نیز موثر می باشند. در این تحقیق ابتدا پروتئین های cfab، intimin و ipac به صورت سه پروتئین مجزا و یک پروتئین کایمر c? که دربردارنده نواحی حفاظت کننده این سه پروتئین می باشد، بیان و تخلیص شدند. در ادامه نانوژل کیتوسان با نسبت 4:1 از کیتوسان: tpp تهیه و پروتئین ها در درون آنها بارگذاری شدند. خصوصیات ساختاری نانوژل ها با روش های sem و dls بررسی گردید. گروه های موشی و خوکچه هندی با پروتئین های cfab، intimin، ipac و c? به صورت تزریقی و نیز به فرم کپسوله به صورت خوراکی ایمن شدند. پس از بررسی تولید آنتی بادی، سلولهای caco2، موشها و خوکچه های هندی به ترتیب با باکتری های etec، ehec و shigella flexneri به چالش کشیده شدند. حفاظت کنندگی ایمن سازی از مسیر خوراکی در حیوانات آزمایشگاهی بیشتر از مسیر تزریقی بود. کلید واژه: کیتوسان، نانوژل، etec ، ehec، shigella ، cfab ، intimin و ipac

pseudomonas aeruginosa عامل عفونت های مختلفی مانند عفونت های مجاری ادراری، عفونت های مربوط به زخم و سوختگی، عفونت های قرنیه چشم و مجاری تنفسی تحتانی می باشد. پروتئین oprf در باکتری p. aeruginosa یک پروتئین سطحی بزرگ غشا خارجی می باشد که ازلحاظ خاصیت آنتی ژنی در بین سویه های مختلف حفظ شده است و می تواند به عنوان یک کاندید واکسن امیدبخش باشد. همچنین این موضوع به خوبی اثبات شده است که ltb یک تعدیل کننده ایمنی قدرتمند با فعالیت ادجوانتی قوی می باشد. هدف اصلی مطالعه اخیر ارزیابی ایمنی زایی پروتئین oprf ترکیب شده با ltb به عنوان یک کاندید واکسن علیه p. aeruginosa می باشد. در ابتدا پروتئین oprf بدون ltb و پروتئین کایمر oprf-ltb در وکتور pet28a(+) همسانه سازی شد. سپس پلاسمید های dna نوترکیب به سلول مستعد e. coli bl21(de3) به عنوان میزبان بیانی انتقال یافت. پروتئین ها بیان شده و سپس استخراج شده و با روش sds-page آنالیز شدند. سپس از طریق کروماتوگرافی میل ترکیبی با کمک ستون ni-nta تخلیص شد و پروتئین ها با روش western blotting تائید شدند. سپس موش های balb/cبا استفاده از پروتئین های oprf و پروتئین کایمر oprf-ltb ایمن شدند و آزمایش الایزا انجام شد.ltb توانست ایمنی زایی oprf را افزایش داد. سپس به منظور ارزیابی ایمنی زایی و حفاظت بخشی این پروتئین ها موش های ایمن شده را سوزانده و با p. aeruginosa مورد چالش قراردادیم. موش های ایمن شده با پروتئین کایمر oprf-ltb ایمنی و حفاظت بخشی بیشتری نسبت به موش های ایمن شده با پروتئین oprf بدون ltb از خود نشان دادند بطوری که درصد زنده مانی موش های ایمن با پروتئین های oprf و oprf-ltb به ترتیب 50% و75% نشان داده شد وهیچ یک از موش های غیر ایمن زنده نماندند (p<0.001).همچنین پس از تشریح موش های ایمن با پروتئین های oprf و oprf-ltb و غیر ایمن کاهش در تعداد باکتری ها در کبد وطحال این موش ها نسبت به موش های غیر ایمن مشاهده شد (p<0.001) .علاوه بر این ایمنی زایی غیرفعال (passive) توانست باعث خنثی سازی بیماری زایی این یاکتری شود. بطوریکه این نتایج اثبات می کند که قابلیت oprf-ltb می تواند به عنوان یک کاندید واکسن برای مقابله با عفونتهای p. aeruginosa پیشنهاد شود.