با توجه به میزان خسارت ناشی از بیماری های قارچی، استفاده از تکنیک های بیوتکنولوژی برای تولید گیاهان مقاوم، از اهمیت ویژه ای برخوردار است. بیان ترکیبی از پروتئین های مرتبط با بیماری زایی منجر به القاء مقاومت چندژنی می شود که از یک سو پایداری مقاومت را به همراه داشته و از سویی دیگر باعث مقاومت به طیف وسیعی از قارچ های بیماری زا می گردد. لذا این تحقیق با هدف جداسازی ژن و ساخت سازه های پلاسمیدی چندگانه، حاوی سه گروه مهم از پروتئین های مرتبط با بیماری زایی pr1، pr2 و pr3، انجام گردید. در این تحقیق، پس از طراحی آغازگرهای اختصاصی، ابتدا دو ژن با ویژگی های متفاوت از خانواده pr1، از ژنوم گیاه توتون جداسازی گردیدند و پس از آنالیزهای مربوط به صحت جداسازی ژن، طی مراحلی تحت پیشبر 35s و پایان دهنده nos در پلاسمید دوگانه pbi121 کلون سازی شدند. در مرحله بعد، کلون سازی دو ژن ضدقارچی مهم دیگر، pr2 (β-1 و 3-گلوکاناز) و pr3 (کیتیناز)، تحت کنترل نواحی تنظیمی مستقل در ناحیه t-dnaی ناقل مذکور، به دو صورت همسو و نا همسو به همراه pr1، طی چندین مرحله انجام شد. به منظور انتقال ژن های مذکور به گیاهان تک لپه از ناقل pipkb010 استفاده شد. پس از افزودن قطعه کوزاک به ابتدای ژن prp-1، کاست کامل ژن مذکور در ناقل ptz57r/t ساخته شد. ژن های کیتیناز و گلوکاناز در ناقلpipubi قرار گرفتند و پس از آن ژن kprp-1 در حد واسط کاست ژن های مذکور قرار گرفت. انتظار می رود که ناقل های سه گانه حاصل از این تحقیق، علاوه بر ایجاد مقاومت پایدار به طیف وسیعی از عوامل بیماری زای قارچی در گیاهان تک لپه و دو لپه، دارای پتانسیل ایجاد مقاومت به باکتری و سایر تنش های زنده و غیر زنده نیز باشند. در نهایت ناقل های مذکور را می توان برای انتقال ژن به گیاهان مختلف با روش اگروباکتریوم و تفنگ ژنی مورد استفاده قرار داد. در نهایت یکی از ناقل های مربوط به تراریخت گیاهان تک لپه به گیاه گوجه فرنگی انتقال یافت و پس از آنالیزهای مربوط به حضور ژن، حضور سه ژن کیتیناز، گلوکاناز و prp-1 در گیاه مذکور تأیید شد.

پسته یکی از مهمترین محصولات کشاورزی کشور ایران است. این محصول همواره مورد حمله گونه های آسپرژیلوس مولد آفلاتوکسین aspergillus flavus و a. parasiticus قرار می گیرد. این توکسین برای سلامتی انسان و حیوانات مضر می باشد. هدف از این مطالعه ردیابی و تعیین تنوع ژنتیکی گونه های مولد آفلاتوکسین در پسته های انباری استان کرمان می باشد. جدایه های آسپرژیلوس از میوه های پسته جدا سازی شده و سپس خالص سازی و شناسایی شدند. برای تعیین نوع و میزان آفلاتوکسین در این گونه ها از روش کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد (hplc) استفاده شد. برای تعیین گونه های مولد آفلاتوکسین از واکنش زنجیره ای پلیمراز pcr استفاده شد. از جفت پرایمر طراحی شده برای ژن ناظر آفلاتوکسین aflr در تست pcr برای تعیین گونه های مولد آفلاتوکسین استفاده شد. تمامی جدایه های a. flavus و a. parasiticus به پرایمر های طراحی شده برای ژن ناظر آفلاتوکسین واکنش مثبت نشان دادند. همان گونه که انتظار می رفت با این جفت آغازگر یک قطعه dna به اندازه bp798 تکثیر شد. تنها جدایه ay28 به پرایمر های مورد نظر تکثیر نشان نداد. این جدایه قادر به تولید آفلاتوکسین در محیط کشت نیز نبود. روش pcr برای تعیین گونه های مولد آفلاتوکسین در مقایسه با سایر روشها، روشی حساس، سریع و اختصاصی می باشد. نشانگر rapd برای تعیین تنوع ژنتیکی در گونه های آسپرژیلوس مولد آفلاتوکسین به کار برده شد. در این روش، نشانگر rapd بین یک جدایه غیر مولد توکسین و سایر جدایه های مولد توکسین تمایزی ایجاد نکرد، اما توانست گونه های . flavus aو a. parasiticus را از هم تفکیک کند.

باکتری erwinia amylovora (burr.) winslow et al., 1992، عامل آتشک سیب و گلابی، یکی از مهم ترین بیماری های درختان میوه دانه دار در ایران می باشد. یکی از موثر ترین روش های کنترل این بیماری استفاده از ارقام مقاوم است. به منظور تعیین میزان حساسیت ارقام سیب، به و گلابی به عامل بیماری آتشک، از شاخص حساسیت واریته ای استفاده شد. درصد نکروز شاخه های مایه زنی شده ارقام با باکتریerwinia amylovora ، در فواصل زمانی 5، 12، 23 و 46 روز پس از مایه زنی، تعیین گردید. ارقام رد دلیشز، اوغاز شیروان، خوشه ای خرو، خوجه اسفراین و مربایی سیب، به عنوان ارقام مقاوم مشخص شدند. پس از مشخص شدن ارقام مقاوم، dna شاخه های قطع شده آن ها در هر بازه زمانی، در سه فاصله 0 - 15، 15 - 25 و 25 - 50 سانتی متری نوک هر شاخه، به طور جداگانه استخراج شد. جهت ردیابی باکتری در ارقام مقاوم، dna باکتری با استفاده از آغازگرهای اختصاصی که یک قطعه bp1269 از dna ژنومی باکتری را تکثیر می کنند، تکثیر شد. نتایج ردیابی مولکولی نشان داد که باکتری در بافت های فاقد علامت ممکن است وجود داشته باشد، بنابراین می توان گفت که تلفیق روش های تشخیص باغی و مولکولی می تواند اطمینان ارزیابی مقاومت ارقام را افزایش دهد.

ملخ chrotogonus trachypterus یکی از مهمترین آفات گیاهان منطقه ی سیستان می باشد که از نظر کمی و کیفی٬ خسارت قابل توجهی را به محصولات منطقه وارد می آورد. با توجه به مشکلات آفت کش های شیمیایی برای انسان٬ جانوران و اثرات مخرب زیست محیطی٬ در این پژوهش زهرآگینی عامل بیمارگر قارچی paecilomyces variotti و عصاره ی گیاه اسپند peganum harmala به عنوان عوامل ایمن در کنترل این آفت بررسی شد. جدایه در آزمایشگاه روی محیط sabouraud dextrose agar+yeast کشت و خالص سازی شد. عصاره ی گیاهی با روش تقطیر استخراج شد. بر این اساس٬ حساسیت حشرات کامل آفت به قارچ با روش آلوده سازی تلقیحی (مایه کوبی) بررسی شد. اثر غلظت های 106 ٬ 107 ٬ 108 ٬ 109 و 1010 اسپور قارچ در میلی لیتر و شاهد (آب مقطر به همراه توئین 20) در چهار تکرار برای هر غلظت و مرگ و میر آنها در مدت 10 روز محاسبه گردید. طی بررسی های انجام شده٬ کمترین میزان تلفات مربوط به غلظت 106 اسپور در میلی لیتر بود. میزان lc50 محاسبه شده قارچ٬ 106×4/4 است. روند افزایش مرگ و میر در جمعیت ملخ ها با افزایش غلظت رابطه ی مستقیم داشت. بیشترین میزان مرگ و میر٬ 90 درصد در غلظت 1010 اسپور در میلی لیتر بود. همچنین٬ اثر غلظت های عصاره ی اسپند (٬30 15 ٬ 7/5 و 3/75میلی گرم بر میلی لیتر) در سه تکرار بر حشرات کامل ملخ در شرایط آزمایشگاهی بررسی شد. میزان lc50 عصاره 6/83 بود. با افزایش غلظت عصاره ی مصرفی٬ درصد مرگ و میر آفت نیز افزایش یافت. بنابراین٬ با توجه به نتایج موجود٬ قارچ p. variotti در غلظت های بالا٬ می تواند عامل کنترل میکروبی خوبی بوده و همچنین عصاره ی اسپند در سنتز آفت کش های طبیعی حائز اهمیت باشد. به طورکلی٬ استفاده از قارچ و عصاره ی گیاهی٬ برای کنترل این آفت در برنامه ی مدیریت تلفیقی آفت بومی سیستان امید بخش می باشد.

گوجه ‏فرنگی با تولید سالانه حدود 50 میلیون تن، جزو محبوب‏ترین سبزی‏ها محسوب می‏گردد. بیماری‏های زیادی باعث کاهش محصول گوجه‏فرنگی یا از بین رفتن این گیاه می‏شوند. یکی از مهمترین و شایع‏ترین بیماری‏های این محصول، بیماری پژمردگی فوزاریومی گوجه‏فرنگی می‏باشد که توسط fusarium oxysporum (schlechtend: fr. ) f.sp. lycopersici (sacc. ) snyder and hassen ایجاد می‏گردد. در این تحقیق ابتدا بوته‏های آلوده و سالم گوجه‏فرنگی از مناطق مختلف استان لرستان جمع‏آوری و در آزمایشگاه عامل بیماری و همچنین 15 جدایه‏ باکتریایی و 27 جدایه قارچی از منطقه ریزوسفر بوته‏های گوجه‏فرنگی جداسازی گردیدند. در مرحله بعد اثرات آنتاگونیستی عوامل باکتریایی و قارچی جدا شده روی قارچ f. oxysporum f.sp. lycopersici در آزمایشگاه به روش کشت متقابل بررسی گردید. اثرات آنتاگونیستی جدایه‏های باکتریایی bacillus subtilis وpseudomonas fluorescens و جدایه‏های قارچی trichoderma harzianum و t. virens و همچنین سم بیولوژیک trichomix-h در گلخانه‏ بررسی شدند. در گلخانه ابتدا مایه تلقیح قارچ بیمارگر f. oxysporum f.sp. lycopersici به نسبت 10 درصد وزنی با خاک سترون گلدانی مخلوط و برای پر کردن یک سوم فوقانی گلدان‏ها مورد استفاده قرار گرفت و دو سوم زیرین گلدان با خاک سترون پر گردید. گلدان‏ها به مدت 25 روز در شرایط گلخانه نگهداری شدند. ارزیابی توان بیوکنترل آنتاگونیست‏ها در کنترل بیماری پژمردگی فوزاریومی به روش آغشته‏سازی خاک به طور همزمان با کشت گیاه گوجه‏فرنگی انجام گرفت. این آزمون در قالب طرح کاملاً تصادفی با کاربرد جداگانه هر آنتاگونیست در سه تکرار انجام شد. تجزیه واریانس داده‏های بدست آمده با استفاده از نرم افزار spss انجام شد و مقایسه میانگین صفات با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5% صورت گرفت. نتایج آزمایش‏های گلخانه‏ای نشان داد که آنتاگونیست‏های باکتریایی b. subtilis و p. fluorescens به ترتیب 100 و 62/50 درصد بیماری را کنترل نمودند و همچنین آنتاگونیست‏های قارچی t. harzianum، t. virens، trichomix-h 50 و trichomix-h 30 به ترتیب 100، 66/67، 62/96 و 55/65 درصد بیماری را کنترل نمودند.

حبوبات از مهم ترین منابع غذایی بشر بوده که در سراسر جهان کشت می شوند، لوبیا گیاهی است، حرارت دوست که بیشترین عملکرد را در خاک های سبک (شنی رسی) و غنی از مواد آلی دارا می باشد. استان لرستان با سطح زیر کشت 24000 هکتار، یکی از مهمترین قطب های تولید این محصول در ایران می باشد. عوامل متعدد عفونی و غیر عفونی باعث ایجاد خسارت بر روی این محصول می شوند که در بین آنها عوامل بیماری زای قارچی بیشترین خسارت را باعث می شوند. ازجمله عوامل قارچی خسارت زا بر روی لوبیا قارچ هایr. solani ، f. solani f.sp. phaseoli و m. phaseolina می باشند. استفاده از سموم شیمیایی جهت کنترل بیماری موجب از بین رفتن میکروارگانیزم های مفید و برهم خوردن تعادل اکولوژیکی می گردد. بنابراین استفاده از مدیریت تلفیقی، کنترل زراعی و مبارزه بیولوژیک بسیار حائز اهمیت می باشد. در این تحقیق به منظور بررسی امکان کنترل عوامل بیماری زای پوسیدگی طوقه وریشه لوبیا در استان، نمونه برداری از مناطق مختلف زیر کشت لوبیا در استان لرستان انجام گرفت و به آزمایشگاه منتقل شدند. پس از کشت بافتهای آلوده بر روی محیطهای کشت آزمایشگاهی مختلف و خالص سازی با روش نوک ریسه، تک اسپور و تک اسکلروت کردن در مجموع تعداد 247 جدایه قارچی جداسازی، خالص سازی و شناسایی گردید. براساس خصوصیات مرفولوژیکی گونه های r. solani، m. phaseolina، f. solani،f. oxysporum ، f. acuminatum، f. culmorum، diversisporum f.، f. equiseti، f. javanicum، f. proliferatum، f. scirpi، semitectum f.، f. virguliforme، fusarium sp، alternaria aternata،cheatomium globosum، cylindrocarpon destructans و a. parasiticus تعیین شدند. بررسی اثرات آنتاگونیستی های قارچی و باکتریایی روی عوامل بیمارگر در شرایط آزمایشگاه به روش آزمون کشت متقابل (dual culture) انجام گرفت. نتایج این آزمایش نشان داد که قارچ r. solani بیشترین بیماریزایی را در بین عوامل بیمارگر دارا می باشد. ارزیابی توان بیوکنترل آنتاگونیست‏های قارچی با تهیه مایه تلقیح و آنتاگونیست های باکتریایی به روش آغشته‏سازی بذور لوبیا در سوسپانسیون اسپور باکتری و همزمان با کشت انجام گرفت. این آزمون در قالب طرح کاملاً تصادفی با کاربرد جداگانه هر آنتاگونیست در چهار تکرار انجام شد. تجزیه واریانس داده‏های بدست آمده با استفاده از نرم افزار spss 22 انجام گرفت. مقایسه میانگین صفات در آزمایشگاه و آزمون های گلخانه ای با استفاده از آزمون دانکن به ترتیب در سطح احتمال 1 % و 5 % احتمال صورت گرفت. ارزیابی درصد و شدت بازدارندگی عوامل آ نتاگونیست نشان داد که گونه r.solani دارای قدرت آنتاگونیستی بالایی برای کنترل عوامل بیماریزا دارا می باشد. نتایج آزمایش‏های گلخانه‏ای نشان داد که آنتاگونیست‏های باکتریایی b. subtilis و p. fluorescens به ترتیب 51/57 و 40/98 درصد بیماری را کنترل نمودند و همچنین آنتاگونیست‏های قارچی t. harzianum و t. virens به ترتیب 48/99 و 42/58 درصد در کاهش بیماری موثر بودند.

نماتود مرکبات (tylenchulus semipenetrans) از جمله نماتودهای مهم مرکبات است که به طور وسیعی در باغ¬های مرکبات دنیا و ایران گسترش داشته و باعث زوال تدریجی درختان و کاهش محصول می¬شود. هدف از این تحقیق، شناسایی تعدادی از جدایه¬های بومی استرپتومایسس جدا شده از خاک¬های مرکبات و بررسی فعالیت ضد نماتودی علیه نماتود مرکبات بود. به منظور بررسی تأثیر عوامل بیولوژیک بر مرگ و میر لاروها، در تابستان 1392 از خاک مرکبات دارای علایم به نماتود و به ظاهر سالم استان های گیلان، مازندران و گلستان نمونه برداری انجام شد. جداسازی باکتری استرپتومایسس در محیط نیمه انتخابی (cga) casein glycerin agar انجام شد. 46 جدایه باکتری استرپتومایسس برای بررسی کنترل لارو مرکبات در شرایط آزمایشگاهی جداسازی و خالص سازی گردید. جهت انجام آزمون بررسی اثر آنتاگونیستی، از نهال¬های یک ماهه راف لمون آلوده به نماتود مرکبات به مدت 3 ماه در شرایط گلخانه نگهداری شد و بعد از نمونه برداری خاک آلوده به آزمایشگاه منتقل و لاروها به روش سینی جداسازی شدند. آزمون در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام شد. در مرگ و میر لاروها در مدت 4 روز ،13 جدایه قابلیت آنتاگونیستی نشان دادند. در بین این 13 جدایه، جدایه¬هایsp13-2 و sp8-3 به میزان 66/49 درصد و جدایه sp23-1 به میزان 33/49 درصد مرگ و میر لاروی بالاترین میزان فعالیت آنتاگونیستی را نشان دادند. شناسایی جدایه¬های تاثیرگذار استرپتومایسس با استفاده از ویژگی¬های ریخت¬شناسی، فیزیولوژی، بیوشیمیایی و مولکولی صورت گرفت. علاوه بر این، ناحیه 16srdna آن¬ها توالی¬یابی و محصول pcr ناحیه ریبوزوم 16srdna هشت جدایه sp8-3, sp23-1, sp15-1, sp13-2, sp4-1, sp8-2, sp8-1, sp16-5 به کشور کره جنوبی فرستاده شد. نتایج حاصل از توالی¬یابی به بانک ژن ارجاع شد و پس از blast کردن توالی در بانک ژن (سایت ncbi) ثبت شد.

به منظور شناسایی فون نماتودهای انگل گیاهی باغ¬های انجیر استان لرستان، طی سال¬های 93-1392 در فصل¬های تابستان و پاییز، تعداد 60 نمونه خاک، ریشه و میوه از باغ¬های مختلف استان جمع¬آوری گردید. نمونه¬ها به آزمایشگاه انتقال داده شدند. استخراج نماتود¬ها به روش سینی و تثبیت و انتقال آنها به گلیسیرین از روش دگریسه انجام گرفت. سپس از نماتود¬های جدا شده اسلاید¬های میکروسکوپی دائمی تهیه و با استفاده از میکروسکوپ نوری مجهز به دوربین دیجیتال و لوله ترسیم خصوصیات مرفومتریکی و مرفولوژیکی آنها مورد بررسی قرار گرفت. پس از ثبت مشاهدات میکروسکوپی با استفاده از کلیدهای معتبر و مقایسه با شرح اصلی اقدام به شناسایی گونه¬های استخراج شده گردید. در این تحقیق 12 گونه نماتود مربوط به 11 جنس از ریزوسفر باغ¬های انجیر استان لرستان شناسایی شد که به شرح زیر می¬باشد. aphelenchus avenae, basiria graminophila, boleodorus thylactus, filenchus vulgaris, helicotylenchus exallus, h. pesudorobustus, merlinius brevidens, neopsilenchus longicaudatus, pratylenchus cruciferus, psilenchus curcumerus, tylenchorhynchus agri, xiphinema index گونه n. longicaudatus و p. cruciferus برای اولین بار از ایران گزراش می¬شوند. گونه n. longicaudatus برای اولین بار در دنیا از ریزوسفر انجیر گزارش می¬شود.

استان فارس دارای حدود 309 هکتار گلابی و 1145 هکتار "به" کاری می باشد. در بازدیدهای سالهای 1386 و 1387 که به منظور بررسی مناطق گلابی خیز از نظر وجود بیماری زوال گلابی انجام گرفت، در چند نقطه از استان در درختان گلابی علائم ریز برگی، قرمزی همراه با لوله ای شدن برگ، خزان شدن قبل از موقع برگها، سرخشکیدگی و زوال مشاهده گردید. با توجه به مشابهت این علائم با علائم زوال فیتوپلاسمایی گلابی (pear decline) از آزمونهای بیولوژیکی و مولکولی برای اثبات همراهی فیتوپلاسما با علائم مزبور استفاده گردید. از درختان علائم دار در استان مذکور پیوندک تهیه شد و بر روی نهالهای سالم گلابی و "به" پیوند گردید. در 4 درخت گلابی و 5 درخت "به" علائم به شکل معمول و در 2 درخت که از پیوندکهای گلابی ارژن پیوند زنی شده بودند علائم بیماری به صورت نکروز و ریز برگی مشاهده شد. پس از یکسال در نهالهای مایه زنی شده با پیوند، علائم بیماری مشاهده شد. عامل بیماری از درختان آلوده شده توسط پیوند بوسیله سس به پروانش سالم انتقال داده شد و پس از 9 ماه در آنها علائم زردی و ریزبرگی ظاهر گردید. از باغات گلابی دانشکده کشاورزی دانشگاه شیراز و روستای زنگنه بخش ارژن در استان فارس، از درختان علائم دار و پسیل گلابی cacopsylla pyricola forster نمونه هایی تهیه گردید. از رگبرگ میانی و دمبرگ نمونه های برگی و نمونه های پسیل، dna کل استخراج گردید. نمونه های dna کل با استفاده از جفت آغازگر عمومی p1/p7 و سپس جفت آغازگر عمومی r16f2n/r16r2 و fo1/ro1، که جفت آغازگر اختصاصی فیتوپلاسماهای گروه افژولش سیب است آزمون pcr دو مرحله ای ((nested-pcr به عمل آمد. که در 12 نمونه گلابی دانشکده کشاورزی دانشگاه شیراز و 7 نمونه گلابی نمونه دشت ارژن، 7 نمونه گلابی و "به" آلوده شده بوسیله پیوند و 3 پروانش آلوده شده توسط سس و همچنین 7 نمونه پسیل گلابی در آزمون pcr دو مرحله ای و با هر دو جفت آغازگر r16f2n/r16r2و fo1/ro1 باندهای مورد نظر به ترتیب 1200 و 1050 جفت باز تکثیر شد و آلودگی آنها به فیتوپلاسما به اثبات رسید. با استفاده از آنزیمهای hinfi، rsai، alui و taqi و محصول pcr دو مرحله ای با جفت آغازگر r16f2n/r16r2 آنالیز rflp به عمل آمد. نقوش حاصل از هضم آنزیمی محصول pcr نمونه های پسیل و درختان علایم دار گلابی و درختان آلوده شده بوسیله پیوند و پروانش آلوده توسط سس با آنزیمها با یکدیگر و با نقوش حاصل از آنالیزهای مشابه در نقاط دیگر دنیا مطابقت داشت. بر اساس علائم بیماری، انتقال با پیوند و سس و واکنش مثبت درختان علائم دار در pcr، بیماری زوال گلابی در استان فارس ماهیت فیتوپلاسمایی دارد. بر اساس تکثیر قطعه پیش بینی شده با fo1/ro1، جفت آغازگر اختصاصی گروه افژولش شاخه سیب (16srx)و با توجه به اینکه میزبان فیتوپلاسمای مورد آزمایش گلابی بوده است و همچنین آنالیز rflp این فیتوپلاسما به عامل زوال گلابی در کشورهای اروپایی (candidatus phytoplasma pyri) شباهت دارد.