ویروس آنفلوآنزا که عامل مولد یکی از بیماریهای حاد تنفسی می باشد در غشا خود واجد گلیکوپروتئین مهمی به نام همآگلوتینین است. این مولکول ضمن اینکه اصلی ترین آنتی ژن برای القا پاسخ ایمنی بر علیه ویروس است، همواره به عنوان مدل ایده آلی برای مطالعه فرآیندهای بیولوژیکی مهم از جمله گلیکوزیلاسیون مورد استفاده قرار گرفته است. گلیکوزیلاسیون ( به ویژه از نوع n) متداولترین تغییر ضمن یا پس از ترجمه ای پروتئینها در سلولهای یوکاریوتی است بطوریکه تقریبا 70% داروها و واکسنهای پروتئینی از نوع n- گلیکوپروتئینها هستند. معمولا برای تولید فرم نوترکیب این پروتئینها از سیستمهای بیانی یوکاریوتی مختلف نظیرمخمرها، سلولهای پستانداران نظیر cho و سلولهای حشرات مانند sf9 استفاده می گردد که هر کدام دارای مزایا و معایب خاص خود می باشند. این سلولها با توجه به امکانات آنزیمی سیستم گلیکوزیلاسیون خود ساختارهای گلیکانی مختلفی را به مولکولهای پروتئینی می افزایند که بر عملکرد این مولکولها به ویژه آنتی ژنیسیته تاثیرگذار می باشند. بنابر این تولید گلیکوپروتئینها به فرم گلیکوزیله در باکتری اشریشیاکلی نوترکیب، که قابلیت مهندسی مسیر گلیکوزیلاسیون در آن وجود داشته باشد، از اهمیت خاصی برخوردار است. با توجه به اینکه، اهمیت گلیکوپروتئین همآگلوتینین ویروس آنفلوآنزا ( به ویژه زیر واحد بزرگ آن ha1) به عنوان آنتی ژن کلیدی برای تولید واکسن آنفلوآنزا به اثبات رسیده است، لذا در این تحقیق زیر واحد بزرگ وآنتی ژنیک مولکول همآگلوتینین(ha1) دراین اشریشیاکلی نوترکیب بیان گردید. برای این منظور ابتدا قطعه ژنی کد کننده زیر واحد بزرگ پروتئین همآگلوتینین به کمک روش reverse transcription-polymerase chain reaction از ویروس استاندارد با تیتر مناسب جداسازی وتکثیر گردید و پس از تعیین ترادف در وکتور بیانی pet22b با پپتید هدایتگر pelb کلون شد. پس ازتایید بیان پروتئین به وسیله sds-page و western blotting در لیزات سلولی و فضای پری پلاسمی، واکنش پذیری آن با آنتی سرم استاندارد ویروسی سنجیده و با آنتی ژن ویروسی استاندارد، مقایسه گردید. سپس با استفاده از سازه حامل سیستم گلیکوزیلاسیون باکتری کامپیلوباکتر ژژونی، باکتری اشریشیاکلی نوترکیب تهیه و پروتئین ha1 ویروس آنفلوآنزا در آن بیان گردید. پروتئین بیان شده در هر دو باکتری از نظر گلیکوزیلاسیون مورد ارزیابی قرار گرفت و با استفاده از روش لکتین بلاتینگ و مهار آن، گلیکوزیلاسیون ha1 درباکتری نوترکیب تایید شد.

نوکلئیک اسیدهای جدا شده توسط روش الکتروفورز ژل آگارز به طور معمول درون شبکه متخلخل ژل با رنگ آمیزی توسط اتیدیوم برومید و سپس پرتودهی با اشعه ماورای بنفش شناسایی می شوند. اتیدیوم برومید یک ماده سمی و موتاژن است که می تواند باعث ایجاد آسیب ژنتیکی شود. باقی مانده این ماده پس از انجام آزمایشات، به همراه مواد زاید وارد چرخه زیست محیطی می شود. به دلیل مصرف بسیار بالای این ماده در سال های اخیر یافتن ماده ای مناسب به عنوان جایگزین، بسیار ضروری است. در این تحقیق به بررسی مواد به کار گرفته شده در رنگ آمیزی نوکلئیک اسیدها و مطالعه ترکیباتی که به طور موثر با dna واکنش می دهند پرداخته شده است.

ویروس آنفلوانزا متعلق به خانواده اورتومیکسوویروس¬ها بوده و از سه نوعa ، b و cتشکیل شده است. ویروس آنفلوانزای گونه¬ی aو b حاوی دو گلیکوپروتئین سطحی به نام¬های هماگلوتینین (ha) و نورامینیداز (na) می¬باشد. ha از یک قسمت کروی به نام سر و یک قسمت میله ای به نام ساقه تشکیل شده است و یک گلیکوپروتئین هموتریمر شامل دو ساب یونیت به نام¬های ha1 و ha2 است. ha آنتی¬ژن اصلی در سطح پوشش ویروس می¬باشد. بیشتر عملکردهای ha تحت تاثیرگلیکوزیلاسیون جایگاه¬های ویژه روی ha می¬باشد. از آنجا که گلیکوزیلاسیون haدر فعالیت پیوند به رسپتور سلول میزبان، فعالیت فیوژن ، انتقال ویروس به داخل سلول میزبان، خواص آنتی¬¬ژنیک ویروس، بیماریزایی و رشد ویروس تاثیر بسزایی دارد، از طرفی گلیکوزیلاسیون ویژه میزبان هماگلوتینین روی کارآیی واکسن و پایداری آن مؤثر است. همچنین ممکن است تمایل ha برای گیرنده های سلولی به وسیله توالی قندهای بیرونی ویژه تنظیم گردد. بنابراین تعیین ترکیب گلیکوزیلاسیون هماگلوتینین ویروس آنفلوانزا ضروری به نظر می¬¬¬رسد. تعیین ساختار زنجیره الیگوساکاریدی ha ویروس آنفلوانزا می¬تواند گامی در راستای مطالعه¬ی بخش قندی ha های گلیکومهندسی شده¬ای باشد که می¬توانند در تولید واکسن با کارآئی بیشتر علیه این ویروس مورد استفاده قرار گیرند. ذدر این پژوهش، گلیکوپروتئین¬های ویروس آنفلوانزا با استفاده از دترجنت غیریونی اکتیل گلوکوپیرانوزید استخراج شدند، سپس ha با روش الکتروالوشن تخلیص گردید و بعد از جدا کردن زنجیره¬های الیگوساکاریدی آن از طریق دگلیکوزیلاسیون شیمیایی با تری فلوئورومتان سولفونیک اسید، قندهای موجود در ساختار قسمت گلیکانی آن با کروماتوگرافی لایه¬ی نازک مورد شناسایی قرار گرفت. این قندها شاملn- استیل گلوکزآمین، گالاکتوز، مانوز و فوکوز بودند.