adp در بسیاری از واکنش های بیولوژیک شرکت می کند و کیت سنجش adp برای سنجش واکنش های آنزیمی با دنبال کردن تشکیل یا مصرفadp استفاده می شود. تاکنون چندین روش برای سنجش adpراه اندازی شده است. یکی از این روش ها بر اساس تبدیل یک به یک adp به atp توسط آنزیم پیروات کیناز، در حضور مقادیر مختلف adp و به دنبال آن اندازه گیری atp تشکیل شده توسط لوسیفرین-لوسیفراز می-باشد. با توجه به نقش کلیدی آنزیم پیروات کیناز (ec 2.7.1.40) در این سنجش ژن کدکننده این آنزیم از باکتری گرمادوست ژئوباسیلوس، در ناقل بیانی pet28-a (+) و باکتری اشریشیاکولی bl-21، کلون، تعیین توالی و بیان شد. این ژن به طول 1764 جفت باز توانایی کدکردن پروتئینی به طول 587 باقیمانده اسید آمینه را دارد. توالی نوکلئوتیدی ژن پیروات کیناز و توالی آمینواسیدی آن %100 مشابه آنزیم پیروات کیناز geobacillus kaustophilus hta426 می باشد. پروتئین نوترکیب به روش کروماتوگرافی تمایلی خالص سازی شد. آنزیم خالص سازی شده برای اندازه گیری adp به روش واکنش جفت شده توسط بیولومینسانس استفاده شد. ویژگی های بیوشیمیایی از قبیل پارامترهای سینتیکی، اثر دما بر پایداری آنزیم، اثر ph و نیز مطالعات ساختاری cd بررسی شد. پارامترهای سینتیکی نشان داد که این آنزیم نسبت به سوبسترای pep، فرآیند تعاونی مثبت هموتروپیک با k0.5 برابر 3/1 میلی مولار اما برای adp با سینتیک میکائیلیس- منتن با km برابر2 میلی مولار با ماکزیم فعالیت در ph برابر با 5/7 و دمای 65 درجه سانتیگراد می باشد.

نانولیپوزوها ذرات کلوییدی می باشند که از دو لایه متشکل از مولکولهای چربی تشکیل شده اند. این ترکیبات محفظه هایی را تشکیل می دهند که ذرات معلق بین آنها به دام می افتند. وزیکولهای لیپوزومی به دلیل اینکه توانایی پتانسیل حمل مولکولهای فعال زیستی را دارند، کاربردهایی را در درمان بیماریهای انسان وحیوان پیدا کرده اند. از این رو توجه محققان به این ترکیبات جلب شده است. لیپوزومها مدلی از غشای بیولوژیک می باشندو اخیرا به عنوان حامل برای انتقال ژن و دارو به ارگان های هدف مورد استفاده قرار می گیرند.از این رو از لیپوزومها در درمان بیماریهای سرطان استفاده می شود. تحقیقات اخیر نشان می دهد که لیپوزومهای کاتیونی توانایی به دام اندازی اسید های نوکلئیک و انتقال آنها به سلولهای هدف را دارند. لیپوزومها کاتیونی به دلیل سمیت پایین، آماده سازی آسان،وابسته نبودن به سایز اسیدنوکلئیک و هزینه کم به عنوان یکی از گسترده ترین سیستمهای غیرویروسی برای انتقال ژن مورد استفاده قرار می گیرند. راههای مختلفی برای افزایش کارایی ترانسفکشن لیپوزوم ها انجام شده است که می توان به استفاده از لیگاندها برای هدفنمد سازی آنها، استفاده از ترانسفرین، استفاده از آنتی بادی هاو سایر موارد اشاره کرد. در این تحقیق برای افزایش کارایی ترانسفکشن و همچنین هدایت این ترکیبات به ارگان هدف، لیپوزومهای کاتیونی حاوی نانوذره مغناطیسی تهیه گردید. این نوع لیپوزومها با قرار دادن نانوذره مغناطیسی داخل لیپوزوم های کاتیونی تهیه شدند. و از یک میدان مغناطیسی خارجی برای هدایت آنها به ارگان هدف و تجمع آن برروی دیواره سلولی استفاده گردید. استفاده از غلظت های بالای مگنت باعث افزایش سایز cls/pdna می-شود. کارایی ترانسفکشن در سلولهای cho با استفاده از ژن گزارشگر لوسیفراز مورد بررسی قرارگرفت. از طرفی استفاده از گزارشگرهای زیستی به دلیل مزیت هایی مانند غیر تهاجمی بودن آنهادر تصویر برداری از داخل بدن موجودزنده مورد استفاده قرار می گیرند. رایج ترین این گزارشگرها ژن لوسیفراز می باشد که نور سبز-زرد تولید می کند. از طرفی لوسیفراز مولد نور قرمز به دلیل اینکه قابلیت عبور از بافت را دارد می تواند به عنوان یک گزارشگر حساس در سیستمهای invivo imaging مورد استفاده قرار بگیرد. در این مطالعه با استفاده از روش fdel لیپوزومهای کاتیونی (cls) و لیپوزوم های کاتیونی حاوی نانوذره ی مغناطیسی (mcls) آماده سازی شدند. جهت تولید لوسیفراز مولد نور قرمز موتانت مورد نظر در وکتور pgl3 که حاوی لوسیفراز طبیعی می باشد تعیین گردید. بارسطحی و اندازه ی (cls, mcls, cls/ pdna, mcls/ pdna) مورد آنالیز قرارگرفت و کارایی ترانسفکشن این ترکیبات بررسی شد.

تولید زیست داروها و پروتئین های نوترکیب با استفاده از گیاهان به عنوان بیوراکتور در حجم انبوه و ارزان تحت عنوان زراعت ملکولی (molecular farming) معرفی می شود. دیابت به عنوان نارسایی سوخت و سازی گروه بندی شده است که در آن بدن از فقدان و یا عدم امکان استفاده از هورمون انسولین رنج می برد. با وجود تولید انسولین در سیستم های باکتریایی و مخمری تحقیقات بیشتر برای سایر روش های تولید پروتئین انسولین شامل بیان در گیاهان متمرکز شده است. گیاه توتون با نام علمی nicotiana متعلق به خانواده solanaceae و گونه tabacumمی باشد که تاکنون بیشترین استفاده را جهت تولید پروتئین های نوترکیب در بین گونه های گیاهی به خود اختصاص داده است. پروتئین های نوترکیب تولیدی در گیاهان می توانند به واحدهای زیرسلولی متفاوت در سلول های گیاهی نظیر سیتوزول، آپوپلاست، شبکه آندوپلاسمی، کلروپلاست و یا واکوئل هدف گیری شوند. انتخاب صحیح واحد زیر سلولی جهت بیان پروتئین نوترکیب، نقش مهمی در سطوح تولید پروتئین های هترولوگ دارد. بیان پروتئین های نوترکیب در کلروپلاست مزایای متعددی نظیر افزایش بیان ژن هدف و محدود نگه داشتن ژن انتقال یافته را به همراه دارد. ژن پروانسولین انسانی به همراه ژن مقاومت به آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین- استرپتومایسین توسط تیم تحقیقاتی دکتر جلالی با استفاده از وکتور pkcz و به روش تفنگ ژنی به کلروپلاست گیاه توتون انتقال یافته است. در قالب این پروژه، مراحل انجام باززایی و انتخاب گیاهان تراریخته بر روی محیط باززایی حاوی آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین به منظور افزایش هموپلاسمی طی حداقل سه نسل انجام شد. بررسی گیاهان ترانسپلاستومیک در سطوح مختلف dna، rna و پروتئین به منظور تایید درج و بیان ژن در کلروپلاست گیاه توتون انجام شد. بررسی این گیاهان در سطح dna با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن پروانسولین، درج این ژن را در ژنوم کلروپلاستی گیاهان تایید کرد، به علاوه با آزمون rt-pcr رونویسی ژن هدف تایید شد. همچنین آزمون های بلات نقطه ای، الیزا و وسترن بلات به منظور اثبات بیان ژن هدف در سطح پروتئین و تعیین میزان پروتئین تولید شده انجام شد. در ادامه این پروژه جوانه زنی بذور نسل t1 روی محیط ms حاوی غلظت های مختلف آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین و استرپتومایسین نیز مورد بررسی قرار گرفت.

atp سولفوریلاز اولین آنزیم در مسیر احیاء سولفات، تولید آدنوزین فسفوسولفات را از atp و سولفات کاتالیز می کند. فعالیت atp سولفوریلاز در مسیر احیاء سولفات، که در بیوسنتز اسیدهای آمینه و دیگر متابولیت های دارای سولفات شرکت می کند به صورت گسترده ای مورد مطالعه قرار گرفته است. atp سولفوریلاز دارای کاربردهای زیادی می باشد از جمله می توان به تشخیص بیولومینومتریک adp در غلظت های بالای از atp، آشکارسازی مداوم فعالیت dna پلیمراز، توالی یابی dna و آشکارسازی باکتری ها اشاره کرد. در این تحقیق ژن atp سولفوریلاز از یک باکتری ایرانی سوش ژئوباسیلوس جدا و سپس در پلاسمید کلونینگ ptz57r/t و در باکتری e. coli dh5? کلون شد. پس از تعیین توالی در پلاسمید بیانی pet28a ساب کلون گردید و در باکتری بیانی e. coli bl21 بیان شد. ژن atp سولفوریلاز کلون شده دارای یک orf با طول 1161 جفت باز می باشد که یک پروتئین با 386 باقیمانده اسید آمینه ای کد می کند. توالی نوکلئوتیدی ژن و آمینو اسیدی پروتئین atp سولفوریلاز کلون شده به ترتیب 99% و 100% با توالی ژن atp سولفوریلاز geobacillus kaustophilus hta426 مشابهت داشت. پروتئین بیان شده با استفاده از ستون کروماتوگرافی تخلیص گردید. داشتن فعالیت آنزیمی برای پروتئین نوترکیب تولید شده با روش لومینسانس ارزیابی شد.

لایزوزیم یک آنزیم ضد باکتریایی است که 5/3 درصد سفیده تخم پرندگان را تشکیل داده و نقش بسیار مهمی را در مکانیسم دفاعی تخم بر عهده دارد. این آنزیم به علت ویژگی های منحصر به فردی که دارا است، کاربردهای گسترده ای در صنعت غذایی، پزشکی و داروسازی پیدا کرده است. در این تحقیق با توجه به پرونده ساختاری لایزوزیم چهار اسیدآمینه آسپارژین، آرژنین، گلایسین و متیونین به جیره غذایی بلدرچین های تخمگذار مکمل شد. برای مکمل سازی اسیدهای آمینه، یکسان بودن محتوای پروتئینی تمام گروه های آزمایشی اساس کار قرار گرفت و بدین منظور مقدار اسیدهای آمینه در گروه-های آزمایشی به گونه ای تنظیم شد که 235/0 درصد پروتئین به جیره پایه مکمل گردید. تعداد 72 قطعه جوجه در قالب طرح کاملا تصادفی با 6 تیمار، 3 تکرار و 4 پرنده در هر قفس مورد استفاده قرار گرفت. مکمل نمودن اسیدهای آمینه اثر مثبت و معنی داری بر روی درصد تولید تخم و توده تخم داشت(05/0 p<)، ضریب تبدیل غذایی در بین گروه های آزمایشی تفاوت معنی داری نشان نداد، لیکن از نظر عددی بهترین ضریب تبدیل مربوط به گروه شاهد بود(05/0p<). وزن پوسته، درصد سفیده، درصد زرده، ارتفاع سفیده، واحد هاو و ارتفاع زرده بین گروه های آزمایشی تفاوت معنی دار نشان دادند(05/0p<) و افزودن اسیدهای آمینه به جیره غذایی بلدرچین ها موجب بهبود این صفات گردید. فعالیت آنزیم لایزوزیم با دو روش لایزوپلیت و کدورت سنجی سنجیده شد، مکمل نمودن اسیدهای آمینه آرژنین و آسپارژین به تنهایی و در ترکیب با یکدیگر موجب افزایش فعالیت آنزیم لایزوزیم در هر دو روش لایزوپلیت (05/0p<) و کدورت سنجی شد(05/0p<). غلظت پروتئین لایزوزیم هم تحت تأثیر افزودن جیره ای اسیدهای آمینه قرار گرفت(05/0p<).

در دهه های اخیر، پیشرفت در زمینه بیوتکنولوژی گیاهی، بویژه زراعت مولکولی (molecular farming) امکان استفاده از گیاهان را به عنوان یک سیستم مناسب جهت تولید بخشی از پروتئین های نوترکیب فراهم کرده است. در این زمینه، مهندسی ژنوم کلروپلاستی به دلیل داشتن مزایای زیاد راهکاری موثر جهت تولید پروتئین های نوترکیب می باشد. تقاضا برای تولید پروتئین های نوترکیب جهت مصارف تشخیصی و درمانی به سرعت رو به گسترش است. یکی از پروتئین های ارزشمند دارویی، اینترفرون گامای انسانی می باشد که کاربردهای پزشکی وسیعی در زمینه های تشخیصی و درمانی دارد. ژن اینترفرون گامای انسانی به همراه ژن مقاومت به اسپکتینومایسین - استرپتومایسین، توسط تیم تحقیقاتی دکتر جلالی در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس و با استفاده از ناقل کلروپلاستی pkczساخته شد و به روش تفنگ ژنی به کلروپلاست گیاه توتون انتقال یافت. هدف از انجام این تحقیق در ادامه تحقیقات قبلی، بررسی پایداری بیان ژن اینترفرون گامای انسانی در گیاهان ترانس پلاستومیک نسل اول توتون بود. به منظور دست یابی به گیاهان تراریخته نسل اول (t1)، ابتدا بذور جمع آوری شده از گیاهان t0به همراه بذور شاهد ضدعفونی شده و سپس بر روی محیط ms حاوی آنتی بیوتیک) اسپکتینومایسین و استرپتومایسین) مورد آزمون قرار گرفتند. گیاهان رشد نموده در سطح محیط انتخابگر، به منظور تائید درج و بیان ژن هدف در کلروپلاست گیاه توتون در سطوح مختلف (dna، rna و پروتئین) مورد آنالیز قرار گرفتند. بررسی گیاهان مورد آزمایش در سطح dna با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن اینترفرون گاما و روش pcr صورت پذیرفت و درج این ژن را در ژنوم کلروپلاستی گیاهان مورد بررسی تایید کرد. با آزمون rt-pcr نسخه برداری و بیان ژن هدف (اینترفرون گامای انسانی) در گیاهان ترانس پلاستومیک تایید شد. همچنین به منظور اثبات بیان ژن هدف در سطح پروتئین و تعیین میزان بیان ژن اینترفرون گامای انسانی، آزمون های sds-page، بلات نقطه ای، وسترن بلات و الیزا انجام شد. آزمون سادرن بلات نیز هموپلاسم بودن گیاهان نسل اول (t1) را تایید کرد.

آپوپتوز یا مرگ برنامه ریزی شده سلول یک نوع از مرگ سلولی می باشد که موجودات چند سلولی جهت حذف سلول های نا مناسب از آن استفاده می نمایند. نکته مهم در خلال حذف این نوع سلول ها این است که فرایند آپوپتوز به حدی کنترل شده و ایمن باشد که به ساختارهای مجاور هیچ نوع آسیبی وارد نشود. در این مطالعه با استفاده از دیدگاه protein complementation assay و تکنولوژی گزارشگر های دو بخشی لوسیفراز یک روش سلولی جدید جهت سنجش آپوپتوز در سطح تشکیل کمپلکس آپوپتوزوم و اولیگو مریزه شدن مولکول apaf1 در مراحل بسیار ابتدائی آپوپتوز ارائه گردید. در این روش ابتدا قطعه آمین آنزیم لوسیفراز ( اسید آمینه های 1-416) به سمت آمین مولکول apaf1 متصل گردید. سپس قطعه کربوکسی آنزیم لوسیفراز (اسید آمینه های 395-550 ) به سمت آمین یک apaf1 دیگر متصل گردید. سلول های ترانسفکت شده با این دو سازه نوترکیب تحت القاء آپوپتوز با داروی doxorubicin در غلظت 0.5میکرو مولار قرار گرفتند. آنالیز های انجام شده جهت سنجش فعالیت لوسیفراز افزایش 15 برابری را تنها چهار ساعت پس از القاء آپوپتوز نشان می داد و این افزایش فعالیت در ظرف مدت 10 ساعت پس از القاء آپوپتوز به 155 برابر در مقا یسه با حالت کنترل می رسد. مقایسه نتایج حاصل از این روش با روش مبتنی بر استفاده از سوبسترای فلوروسنت که کاسپاز های فعال شده 3 و 7 را اندازه کیری می کند نشان می داد که از نظر زمانی روش ارائه شده 5 ساعت زودتر توان اندازه گیری آپوپتوز را دارا می باشد. همچنین نسبت افزایش سیگنال مشاهده شده در دو سیستم نشان دهنده بهبود وضعیت signal/noise در سیستم لوسیفراز دو بخشی می باشد. این سیستم گزارشگر می تواند به صورت موثری جهت بررسی پتانسیل شیمی درمانی ترکیبات متفاوت و همچنین مطالعات غلظتی و زمانی این ترکیبات مورد استفاده قرار گیرد

در بیماری als نیز بیماران مبتلا دارای تجمعات پروتئینی در جسم سلولی و آکسونهای نورونهای حرکتی بافت عصبی خود می باشند که بطور عمده متشکل از آنزیم سوپراکسید دیسموتاز 1 (sod1) است. جهش در ژن sod1 در 20% از موارد familial als (fals) مشاهده می شود و به عنوان یک عامل مهم در ایجاد این بیماری شناخته می شود. مکانیزم بیماری زایی تجمعات sod1در بیماری fals اگر چه هنوز به طور کامل مشخص نیست اما تغییر در خصوصیات غشا، ازجمله نفوذ پذیری و به همریختگی یکپارچگی (خصوصا در حضور حدواسط های اولیگومری) آن به عنوان یک مکانیسم مطرح باشد.

در این تحقیق جذب رشته های مختلف dna به نانوذرات کلوئیدی طلا و نقره بررسی شده است و طیف پلاسمونی نانوذرات در حضور رشته های مختلف dna اندازه گیری شد. نشان داده شد که عوامل متعددی همچون جنس نانوذرات فلزی و ساختار بازی dna در این بر هم کنش دخیل است که تاثیر آن به مراتب بیشتر از هندسه dna می باشد. نتایج نشان می دهد که نانوذرات نقره به دلیل اختلاف بهتری که در پیک های آن مشاهده می شود و ارزان تر بودن نقره و همچنین زمان کم آزمایش برای نقره، برای کاربرد حسگری بهتر از نانوذرات طلا عمل می کنند. اندازه های مختلف نانوذرات طلا برای کاربرد حسگری استفاده شد و نشان داده شد که نانوذرات با اندازه های بزرگ و با روش ساخت 30 نانومتر برای این منظور مناسب نمی باشند. همچنین جذب نانوذرات و رشته های تک بازی به منظور بررسی میزان جذب هر نوع باز به نانوذره بررسی شد. باز نوع a بیشترین خاصیت پوشانندگی و بیشترین چسبندگی را به نانوذرات دارد و در مقابل باز نوع g کمترین چسبندگی و کمترین اثر محافظتی را از خود نشان می دهد.

فیتواکدیستروئیدها، آگونیست های هورمون پوست اندازی حشرات به شمار می روند که به صورت گوارشی و تماسی موجب اختلال در متابولیت های حدواسط، رشد و نمو، تولید مثل و در نهایت کاهش جمعیت آفت می شوند. در این پژ‍وهش اثر عصاره های فیتواکدیستروئیدی سیلن ایرانیsilene aucheriana boissو میخک شرقیdianthus orientalis adams و فرمولاسیون نانوکپسوله شده آن بر تفریخ تخم، مرگ و میر و تخمریزی بید کلم plutella xylostella (l.) (lepidoptera: plutellidae) در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت. بید کلم یکی از مخرب ترین آفت گیاهان تیره کلمییان در سرتاسر دنیا می باشد که تقریباً به اکثر آفتکش های شیمیایی مقاوم شده است.از طرفی شواهدی از وجود ترکیبات اکدیستروئیدی در گیاهان مورد تغذیه این آفت گزارش نشده است. در این پ‍ژوهش وجوداکدیستروئیدهای20-hydroxyecdysone (20e)، polypodin b (polb) و integristerone a (inta)در گیاه سیلن ایرانی و اکدیستروئیدهای20e و polb در گیاه میخک شرقی به اثبات رسید. مقادیر 20eدر سیلن ایرانی و میخک شرقی به ترتیب 3598/69و5527/22 میکرو گرم در 100 گرم وزن خشک گیاه بود. همچنین فرمولاسیون نانوکپسوله شده عصاره سیلن ایرانی به روش رسوب دهی در نمک و با استفاده از پلیمر سدیم آلژینات تولید شد. در فرمولاسیون نانو کپسول، اندازه ذرات تولید شده به 10 نانومتر رسید. اثر تماسی فرمولاسیون نانو کپسوله خاصیت تخم کشی بالایی از خود نشان داد به طوری که در غلظت 0/5 درصد 100 درصد تخم ها تلف شدند. این در حالی است که حداقل غلظت 2 درصد از عصاره غیر فرموله برای تلفات 100 درصد تخم لازم بود. اثر گوارشی نانو کپسول روی لاروهای سن سوم موجب کاهش وزن لارو و شفیره ها تا 30 درصد پایین تر از شاهد شد. همچنین فرمولاسیون نانو کپسول مورد تغذیه توسط لاروهای سن سوم موجب کاهش شدید تخمریزی در حشرات کامل شد به طوری که در غلظت 0/5 درصد میزان باروری نسبت به شاهد تا 85 درصد کاهش یافت و این اثر نسبت به عصاره فرموله نشده تا حدود 80 برابر قویتر بود. در این مطالعه برخی ذخایر غذایی و متابولیت های بیوشیمیایی در لاروهای سن سوم که به مدت دو روز از عصاره های اکدیستروئیدی تغذیه کرده بودند، اندازه گیری شد. به طور کلی پس از چهار روز میزان چربی کل، پروتئین محلول با افزایش غلظت کاهش، اما اسید اوریک افزایش یافت. همچنین فعالیت آنزیم های آسپارتات آمینوترانسفراز (ast)، آلکالین فسفاتاز (alp) و آمیلاز با افزایش غلظت کاهش یافت. بنابراین بخشی از اختلال رشد و کاهش باروری را می توان به اختلال های متابولیکی ایجاد شده در حشره نسبت داد. با توجه به اثر بخشی بالای فرمولاسیون نانوکپسول حاوی عصاره های فیتواکدیستروئیدی و کم خطر بودن آن برای محیط زیست، می تواند در آینده نوید بخش استفاده کاربردی از این عصاره ها به جای سموم شیمیایی برای تولید محصولات سالم باشد.

پیشرفت های اخیر در زمینه مهندسی نانوساختارها و طراحی در سطوح مولکولی منجر به توسعه کاربرد نانوزیست مواد در ژن رسانی، دارورسانی، مهندسی بافت و تصویربرداری شده است. در این میان نانو زیست مواد مبتنی بر پپتیدها به دلیل تنوع ساختاری و انعطاف پذیری در طراحی، توجهات بسیاری را به خود جلب کرده اند. ژن درمانی انتقال ژن جدید به داخل سلول های یک فرد بیمار جهت درمان است. مانع اصلی انتقال موفقیت آمیز ژن به سلول های بدن بیماران، عدم وجود حامل مناسب انتقال ژن می باشد. ویژگی های اصلی یک حامل مناسب و کارا جهت کاربردهای بالینی عبارتند از عدم سمیت، عدم ایمنی زایی، کارایی انتقال ژن بالا، اختصاصیت برای سلول های هدف و باصرفه بودن از لحاظ اقتصادی است. مطالعات بسیاری در زمینه حامل های انتقال ژن در حال انجام است و پیشرفت های چشمگیری حاصل شده است. با وجودی که انتقال ژن با استفاده از ویروس ها با کارایی بالا انجام می شود اما این روش با محدودیت هایی بسیار از جمله احتمال برگشت ویروس به حالت بیماریزایی، ایمنی زائی و ظرفیت پایین برای ماده ی ژنتیکی، مواجه است. روش جایگزین برای انتقال ژن استفاده از سیستم های غیر ویروسی است. لیپیدهای کاتیونی یا لیپوزوم های کاتیونی، پلیمرهای کاتیونی، پروتئین و پپتیدهای کاتیونی از جمله شناخته شده ترین سیستم های غیرویروسی به شمار می روند. علی رغم کارایی پایین تر انتقال ژن در این سیستم ها نسبت به سیستم های ویروسی، به دلیل سمیت پائین تر بسیار مورد توجه قرار گرفته اند. یکی از حامل های مهم انتقال ژن به سلول های یوکاریوتی پپتیدهای کایمریک سنتز شده با روش های مهندسی ژنتیک است. این پپتیدها متشکل از دمین های متعددی هستند که با الهام و تقلید از توالی های پپتیدی موجود در طبیعت به ویژه ویروس ها طراحی شده اند و تولید و سنتز آن ها با کمک سیستم های زیستی همچون باکتری e. coli انجام می شود. ویژگی اصلی این حامل ها در مقایسه با سایرین، موفقیت آن ها در غلبه بر سدهای سلولی همچون غشای سلولی، لیزوزوم و غشای هسته می باشد. در این پروژه ابتدا تمرکز بر روی طراحی، کلونینگ ژن، بیان و تخلیص سه نوع پپتید کایمریک قرار گرفت. این پپتیدها در ساختارشان دارای سه دمین اصلی به قرار زیر هستند: 1) دو تکرار از توالی 16مری پپتید کوتاه شده ی هیستون h1 جهت اتصال به dna پلاسمیدی، 2) فیوژن پپتید مشتق شده از گلیکوپروتئین 41 ویروسhiv جهت خروج از غشاء اندوزوم و 3) سیگنال قرارگیری در هسته یا nlsکه متعلق به آنتی ژن t بزرگ ویروسsv40 می باشد. در ادامه پروژه، توانایی تشکیل کمپلکس پایدار بین پپتیدهای مورد نظر و dna پلاسمیدی و در نهایت کارایی ترانسفکشن کمپلکس های حاصل به سلول های یوکاریوتی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان دادند که پپتیدهای مورد بررسی به طور موثری با dna پلاسمیدی اتصال برقرار کرده و نانوذراتی با میانگین اندازه ی ذره ای حدود 100 نانومتر ایجاد می کنند. همچنین مشخص شد که دمین فیوژن پپتید مورد استفاده در ساختار این پپتیدها، قادر به نفوذ به غشاء اندوزوم می باشد. بازده بالای ترانسفکشن نانوذرات حاصل، حاکی از موفقیت آن ها در انتقال ژن به سلول ها می باشد و نویدی برای تشکیل حامل های ژن غیرویروسی موثر و غیر سمی به شمار می روند.

آنزیم تک زنجیره ای حاوی مس تیروزیناز، یک گلیکوپروتئین غشایی نوع i است که به گروه پروتئین های وابسته به مس نوع 3 تعلق دارد. این آنزیم در جایگاه فعال خود دارای دو اتم مس است که هریک توسط سه ریشه ی بسیار حفظ شده ی هیستیدین در موقعیت مناسب برای واکنش قرار می گیرند. تیروزیناز انسانی از اکسیژن ملکولی برای انجام دو مرحله ی اول مسیر سنتز ملانین یعنی ارتو-هیدروکسیلاسیون l-تیروزین به l-دوپا (فعالیت تیروزین هیدروکسیلازی) و اکسیداسیون متعاقب آن ها به دوپاکینون (فعالیت دوپا اکسیدازی) استفاده می کنند. در پژوهش قبلی این آنزیم برای به دست آوردن نوع جهش یافته ی دارای فعالیت دوپا اکسیدازی بیشتر مورد مهندسی پروتئین قرار گرفت. m374 یک ریشه ی بسیار حفظ شده در خانواده ی پروتئین های مس نوع 3 است که در جایگاه فعال تیروزیناز انسانی قرار گرفته است. این اسید آمینه در پژوهش قبلی با چهار اسید آمینه ی ترئونین (m374t)، آسپارتیک اسید (m374d)، لیزین (m374k) و آرژینین (m374r) تعویض شد و فعالیت اختصاصی آنزیم نوترکیب و این چهار جهش یافته در سویه ی e.coli bl21 مورد بررسی قرار گرفت. مشخص شد که دوجهش یافته ی اول فعالیت دوپا اکسیدازی بالاتری نسبت به نوع نوترکیب آنزیم دارند. در پژوهش کنونی، آنزیم نوترکیب به همراه دو جهش یافته ی اول به عنوان مدلی برای بررسی فعالیت دوپا اکسیدازی تیروزیناز انسانی در رده ی سلولی hek-293 بیان شدند. توالی های رمز کننده ی تیروزیناز پیشتر در حامل pet-28a(+) کلون شده بودند. قدم اول سابکلون قطعات رمز کننده ی تیروزیناز طبیعی و انواع جهش یافته m374d و m374t در pcdna3.1/his/lacz بود. برای معادل سازی تولید پروتئینی با شرایط تاخوردگی مشابه در تروزیناز های یوکاریوتی، توالی رمز کننده ی lacz به طور کامل خارج شده و توالی های رمز کننده تیروزیناز بدون حضور سیگنال نشانه به جای آن کلون شدند. برای تهیه میزان کافی از واریانت های آنزیمی مورد نظر برای اندازه گیری های بیوشیمیایی، نزدیک به 9 میلیون سلول hek293 با هر واریانت ترانسفکت شد. پس از گذشت نزدیک به 30 ساعت از زمان ترانسفکشن، هرنمونه با استفاده از بافر لیز-اتصال، لیز شد و محتویات آن با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی خالص سازی شدند. فعالیت آنزیمی هیچ یک از نمونه ها قابل تشخیص نبود. برای کمک به تاخوردگی بهتر انواع آنزیمی، مراحل ترانسفکشن، لیز و خالص سازی همانند آنچه شرح داده شد، مجدداً انجام گشت. تنها تفاوت افزوده شدن l-dopa استریل با غلظت نهایی 1 mm به سلول ها بود. این بار نیز فعالیت آنزیمی قابل تشخیصی مشاهده نشد. تمام مراحل فوق بار دیگر تکرار شد و l-dopa با cuso4 با غلظت نهایی ?m 100 جایگزین شد. از آنجایی که فعالیت آنزیمی مشاهده نشد، حضور احتمالی یک مهار کننده در مراحل مختلف بررسی شد. مشخص شد که nacl مهار کننده تیروزیناز بوده و قادر به مهار کامل فعالیت تیروزیناز در غلظت ?m 800 می باشد. به همین منظور به جای خالص سازی نمونه های آنزیمی، فعالیت نسبی نمونه-های مختلف بررسی گشت. کلیه مراحل لیز سلول های ترانسفکت شده در داخل بافر pbs محتوی تریتون x-100 و مهار کننده ی پروتئاز انجام شد. پس از بررسی نمونه ها، جذب در محدوده ی 03/0-02/0 برای تمامی نمونه ها مشاهده شد که به دلیل پایین بودن مقادیر مشاهده شده نمی توان با اطمینان کامل آن را مرتبط به فعالیت دوپا اکسیدازی دانست. برای اطمینان از بیان مناسب سازه ها rt-pcr نیمه کمی در سطح rna و آنالیز وسترن بلات در سطح پروتئین انجام شد که نشان دهنده ی تولید شدن تمامی نمونه های آنزیمی در هر دو سطح بود. آنالیز وسترن بلات غلظت بسیار پایینی از تمامی نمونه ها نشان دارد. به همین دلیل اندازه گیری فعالیت آنزیمی نیازمند تهیه رده های سلولی که دائماً واریانت های مختلف آنزیم را تولید کنند است و کشت این رده های سلولی در حجم های بیشتر باید انجام گیرد که شامل حداقل 20 میلیون سلول در حال کشت برای هر نمونه می شود.

تمرین تناوبی شدید با حجم کم؛ ظرفیت هوازی عضله اسکلتی را افزایش می دهد، اما هنوز اطلاعات کمی در مورد سازوکارهای بالقوه در بهبود این سازگاری شناخته شده است. هدف از پژوهش حاضر، بررسی اثر 4 هفته تمرین تناوبی شدید بر میزان پروتئینpgc-1?/? ، err? و vegf در عضله اسکلتی انسان بود. 8 دانشجوی مرد فعال داوطلبانه و به طور هدفمند در این پژوهش شرکت کردند. آزمودنی ها یک هفته پیش از آغاز اجرای پژوهش با نحوه اجرا و چگونگی انجام برنامه آشنا شدند. قبل از تمرینات آزمودنی ها یک آزمون ورزشی فزاینده را برای تعیین vo2max اجرا کردند. هم چنین نمونه برداری از بافت عضله پهن خارجی، 48 ساعت قبل از تمرینات و 72 ساعت پس از آخرین جلسه تمرین انجام شد. برنامه تمرین تناوبی شدید شامل 11 تا 15 وهله 1 دقیقه ای با 90-85 درصد ضربان قلب ذخیره ای و 1 دقیقه برگشت به حالت اولیه فعال بین وهله ها، 3 روز در هفته برای یک دوره 4 هفته ای بود. متغیرهای مورد بررسی با روش الایزا اندازه گیری شدند. داده ها با آزمون t زوجی و در سطح معناداری 0/05 >p تجزیه و تحلیل شدند. نتایج پژوهش نشان داد که 4 هفته تمرین تناوبی شدید منجر به افزایش معنادار pgc-1? ،err? و vegf (p<0/05) و هم چنین افزایش غیرمعنادارpgc-1? (0/05<p) گردید. یافته های حاضر پیشنهاد می کند که فعال سازی vegf از مسیر pgc-1 بخشی از سازوکارهای سلولی - مولکولی تمرینات تناوبی شدید می باشد. بنابراین احتمالاً رگ زایی در عضله اسکلتی یکی از عوامل موثر در بهبود اجرای هوازی در این گونه تمرینات است، که نیازمند مطالعات بیشتری می باشد.

کلسترول اکسیداز ( cho, ec 1.1.3.6) یک الکل دهیدروژناز/ اکسیداز متعلق به خانواده ی گلوکز -متانول-کولین (gmc) اکسیدوردوکتاز و وابسته به فلاوین آدنین دی نوکلئوتید (fad) است که اکسیداسیون کلسترول (cholest-5-en-3?-ol) را با مصرف اکسیژن مولکولی برای ایجاد cholest-4-en-3-one و پراکسید هیدروژن (h2o2) کاتالیز می کند. با توجه به ویژگی سوبسترایی و فعالیت، کلسترول اکسیداز مشتق شده از سویه های استرپتومایسس در کیت های سنجش کلسترول مورد استفاده قرار می گیرند. در این تحقیق نیز از یک سویه ی بومی استرپتومایسس استفاده شد. ژن مورد نظر پس از تکثیر، در وکتور بیانی pet28a کلون و در باکتریdh5? e.coli انتقال یافت و آنالیز توالی انجام گرفت.بیان پروتئین در سویه bl21 e.coli مورد بررسی قرار گرفت، از آنجایی که درصد بالایی از پروتئین به شکل اجسام توده ای بیان می شدند، به منظور افزایش بیان پروتئین به فرم محلول شرایط مختلف دمایی، زمانی و میزان القاکننده iptg در سویه های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. پس از بهینه سازی شرایط بیان، تخلیص آنزیم، با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل-سفاروز انجام و فعالیت آنزیم سنجیده شد.

با وجود تلاش های بسیاری که در زمینه کشف مکانیسم های مولکولی و سلولی دخیل در سرطان صورت گرفته است، همچنان برخی از موارد حل نشده باقی مانده است. از جمله این مسایل تولید نسل جدیدی از عوامل درمانی موثر و ایمن است که به طور اختصاصی تغییرات ایجاد شده در سلول های سرطانی را هدف قرار دهد. در این رساله، سنتز نوعی نانوحامل دارویی برای درمان سرطان سینه از طریق ژن درمانی به صورت هدفمند، پیشنهاد شده است. برای دست یابی به این هدف، sirna مهار کننده بیان ژن itpa که پیشتر شواهدی از نقش آن در کاهش سرعت تکثیر و ایجاد اختلال در ماده ژنتیکی سلول ها گزارش شده بود، توسط نانولوله های کربنی زیست سازگار شده به عنوان حاملی کارامد، به سلول های سرطانی انتقال یافت. برای زیست سازگار نمودن نانولوله های کربنی، سطح این پلیمرها با اسیدآمینه ی آرژنین پوشانده شد و میزان زیست-سازگاری آن با تست های بررسی سمیت مورد آزمایش قرار گرفت. پس از آن نانوحامل سنتز شده به فولات که بیان گیرنده آن در سلول های سرطانی به شدت افزایش می یابد، اتصال یافت. در گام بعدی عامل درمانی که همان sirna اختصاصی برای ژن itpa بود به نانوحامل متصل گردید. پس از بررسی صحت ساخت نانوسامانه ی مورد نظر توسط روش های متعددی از جمله ft-ir، رامان، میکروسکوپ الکترونی، uv اسپکتروسکوپی و تکنیک های رنگ سنجی، itpa sirna به سلول های سرطانی ترانسفکت گردید. در نهایت با بررسی میزان بیان ژنitpa توسط real-time pcr و میزان آپپتوز سلول های سرطانی که در معرض نانوسامانه ی سنتز شده قرار گرفته بودند با فلوسایتومتری، میزان اثرگذاری نانوسامانه ی مورد نظر در کاهش سرعت تکثیر سلول های سرطان سینه مورد بررسی قرار گرفت. داده های حاصل از بررسی ترانسفکشن با میکروسکوپ فلورسنت، کارآیی بالای نانولوله های کربنی در انتقال ژن به داخل سیتوپلاسم را اثبات نمود و نتایج بررسی عملکرد sirna طراحی شده، نشان دهنده ی کاهش بیان ژن itpa در سلول های سرطان سینه بود که منجر به رخداد آپپتوز در این سلول ها گردید.