با توجه به اهمیت ویروس هپاتیت c (hcv) به عنوان عامل تهدید بهداشت عمومی وعدم دسترسی به مقادیر انبوه آنتی ژن کورآن به عنوان تنها پروتئین با ثبات و پروتئین کاندید واکسن، بیان آنتی ژن کور بالغ نوترکیب نوع بومی در اشرشیا کلی مطالعه شد. بررسی بیان سه سازه بیانی ساخته شده در این تحقیق تفاوت معنی داری را به لحاظ سطح بیان نشان داد. علیرغم اختلاف ظاهرا جزیی سه سازه در سطح ژن، در سطح بیان ودر شرایط یکسان برای هر سه سازه تفاوت به لحاظ کمی چشمگیر بود. بالاترین و با ثبات ترین بیان مربوط به سازه petpelbcore بود. مطالعه بیشترو بررسی مقایسه ای میزان وفور کدونهای نادر، محتوی در صد gc ومیزان کمی بیان در سه سازه بیانی نشان داد که درصد gc سازه هادر حد طبیعی(70-30%) است ولی به لحاظ توزیع درصدکدون و انطباق کدونهای سه سازهpelbcore ، ntcore وhiscore با سیستم بیانی اشرشیا کلی به ترتیب %62، %58 و %54 می باشد. میزان بیان سازه pelbcore بیش از دوبرابر پیش بینی شده، نشان دهنده تاثیر شاخص های دیگر موثر بربیان مانند جایگاه محل اتصال ریبوزوم (rbs) و موقعیت aug آغازین در mrna بودند. برای ترشحی کردن پروتئین بیانی و همچنین توسعه کمی بیان، تاثیرچند نوع محیط کشت بر میزان بیان وامکان ترشحی کردن پروتئین در فضای پریپلاسمی بررسی شد. از بین محیط های انتخاب شده کمترین بیان مربوط به محیط واجد گلوکز و بیشترین آن مربوط به محیط lb بود اما محیط های واجد پپتون یا گلیسرول در حد هم و در مرتبه بعدی بودند. وسترن بلاتینگ و تعیین توالی پروتئین ضمن تایید صحت پروتئین نوترکیب، عدم وجود آن را در فضای پریپلاسمی و پردازش نشدن سیگنال را اثبات کرد. البته مقداری پروتئین محلول گرفتارشده در غشاء نیز وجود داشت که هنگام استحصال فرم نامحلول پروتئین، آزاد شذ. سینتیک رشد باکتری همچنین بیان پروتئین هدف در فرمانتور در شرایط fed-batch با نرخ رشد متغیر بررسی شد. طی فاز رشد نمایی حداکثر میزان بیان پروتئین هدف بالغ بر 13% پروتئین تام سلولی بود. مطالعه توالی پروتئین نوترکیب pelb::core از نظروجود توالی های مستعد بتاآگریگه شدن نشان داد که سیگنال گرچه میزان بیان را افزایش داده اما احتمالا میزان آگریگه شدن ذاتی آنرا هم توسعه داده است. البته تایید این یافته نیازمند پژوهش بیشتر است.

گلوکز-1-اکسیداز فلاووپروتئینی است که با استفاده از اکسیژن مولکولی، اکسیداسیون بتا-دی-گلوکز را به دی-گلوکونو-دلتا-لاکتون و پراکسید هیدروژن کاتالیز می کند. در تحقیق حاضر تغییرات ساختاری و سینتیکی آنزیم گلوکزاکسیداز از آسپرژیلوس نیجر مورد بررسی قرار گرفت. برای آنالیز ساختاری آنزیم های اولیگومری تئوری غیر فعال سازی حرارتی و قفل کنفورماسیونی به کار می رود. در این مطالعه، با اعمال دماهای مختلف، غیر فعال سازی حرارتی آنزیم دایمر گلوکزاکسیداز و میزان کاهش فعالیت آن مورد بررسی قرار گرفت. متعاقب اعمال دماهای متفاوت به آنزیم و سردسازی، فعالیت آنزیم اندازه گیری شد. از داده های سینتیکی حاصل برای به دست آوردن پارامتر تجربی n، استفاده شد که تعداد محل های برهمکنش در سطح مشترک را می دهد که این مقدار برای آنزیم گلوکزاکسیداز حدود 2 به دست آمد. در دماهای پائین آنزیم حالت طبیعی (دایمر) دارد و میزان فعالیت بالا می باشد اما در دماهای بالا آنزیم مجتمع شده و فعالیت تقریباً از بین می رود. با روش پراکنش نوری پویا (dls) نتایج فوق تائید شد. برای بررسی ساختار دوم و سوم آنزیم در طی غیر فعال سازی حرارتی، به ترتیب طیف سنجی دو رنگ نمائی دورانی و فلوئورسانس انجام گردید که نتایج حاصله نشان داد که با افزایش دما، ساختار دوم و سوم آنزیم دستخوش تغییر می شود و در یک گستره دمائی کوتاه (55 تا 60 درجه سانتیگراد)، آنزیم یک حالت مولتن گلوبول مانند دارد. برای توصیف نتایج تجربی و روشن شدن ساختار قفل های کنفورماسیونی در گلوکزاکسیداز از ساختار کریستالوگرافی آن استفاده شد.

پایداری ساختاری پروتئین های دارویی در افزایش اثربخشی و کاهش عوارض جانبی بر بدن بیمار موثر است. پایدارسازی و کاهش تشکیل توده در پروتئین ها می تواند در افزایش بازده و کاهش هزینه های تولید تاثیرگذار باشد. در این مطالعه پایداری اینترفرون بتا یک-بی تاخورده به کمک روش های فیزیکی و محاسباتی مانند طیف سنجی های فلورسانس و دورنگ نمایی دورانی بررسی شد. نتایج پژوهش نشان داد اینترفرون بتا یک-بی در فرآیند بازتاخوردگی تشکیل ساختاری واسط، فعال و نیمه پایدار می دهد. در حضور تری هالوز با غلظت 5/1 مولار، مقدار دمای ذوب اینترفرون بتا یک-بی به میزان 16 درجه ی سلسیوس افزایش یافته و ساختاری فوق پایدار و فعال شکل گرفت. این پایداری در ساختمان پروتئین به طور احتمال به دلیل دفع تمایلی تری هالوز و تشکیل سطحی آب پوش در اطراف اینترفرون بتا یک-بی است. حذف تری هالوز سبب افت 16 درصدی در ساختارهای مارپیچی شد. شناخت سازوکار تشکیل توده ی اینترفرون بتا یک-بی به کمک تحریک دمایی، اکسیدی و بذرافشانی محلول پروتئینی انجام شد. تشکیل توده توسط روش های پراکندگی نور پویا، سنجش ردیابی نانوذرات، طیف سنجی ماورای بنفش و مشاهده ی عینی بررسی شد. داده های تجربی با مدل خودکاتالیزی به خوبی منطبق بودند. تحریک اکسیدی پروتئین با پراکسیدهیدروژن در مقایسه با تحریک دمایی سبب افزایش بیشتری در ثابت سرعت هسته زایی (k1) توده ی اینترفرون بتا شد. با تغییر دما از 25 به 70 درجه سیلسیوس، k1 از min-1 4-10×2/0±5/1 به min-1 3-10×1/0±0/6 تغییر یافت، در حالی که در حضور 0/3 % (v/v) پراکسیدهیدروژن تا min-1 100×1/0±0/1 افزایش پیدا کرد. نتایج نشان داد، هسته زایی محدودکننده سرعت در تشکیل توده ی اینترفرون بتا یک-بی در این پژوهش مونومرهای اکسیدشده ی اینترفرون بتا به عنوان ساختارهای پیش هسته ی ناپایداری معرفی شدند که با تغییر در ساختارفضایی خود تمایل به تشکیل توده ی غیرطبیعی دارند. اثر بازدارندگی برخی افزودنی ها بر تشکیل توده ی محلول حاوی اینترفرون بتا یک-بی بررسی شد. در حضور آرژنین k1 از 1-min 3-10× 4/1±4/5 به 1-min 10-10×4/0±5/2 تغییر کرد، که نشان دهنده ی کاهش تشکیل توده ی پروتئینی در محلول است. فرمول بندی جدیدی با mm 200 آرژنین و تری هالوز برای محلول اینترفرون بتا یک-بی ارائه شد. پس از یک ماه کاهشی تقریبا 70% در فعالیت نمونه ی بدون افزودنی حاصل شد، درحالی که تنها 15% کاهش در فعالیت ضدویروسی فرمول بندی جدید مشاهده شد.

هدف از این تحقیق مطالعه بر هم کنش آلبومین سرم انسانی با داروهای پروپرانولول و آلپرازولام در غیاب و حضور دو فلاونوئید کوئرستین و تاکسیفولین و دی متیل متیل فسفونات در بافر فسفات ( (ph = 7.4به وسیله روش های مختلف طیف سنجی فلورسانس، فروسرخ ، مدل سازی مولکولی و شبیه سازی دینامیک مولکولی است.

مطالعات سینتیکی و اتصالی آنزیم ‏‎rnase a‎‏ در برابر سوبسترای پلیمری ‏‎rna‎‏و نیز 3-ریبونوکلئوتیدهای آزاد، در محیط بافری تریس ‏‎edta-‎‏ (100 میلی مولار تریس؛ ‏‎ph7/5‎‏؛ 2 میلی مولار ‏‎edta‎‏) و در دمای 37 با استفاده از روش طیف نور سنجی افتراقی انجام شده است. منحنی اشباع سنتیکی آنزیم با شکل غیر هیپربولیک خود نمایانگر امکان تبدیل دو ساختار فضائی متفاوت از آنزیم به یکدیگر می باشد که در محدوده بسیار باریکی از غلظت سوبسترا واقع می گردد. در غلظتهای پائین سوبسترا بواسطه میانکنشهای فی ما بین چهار زیرجایگاه موجود در جایگاه فعال آنزیم، تجلی منحنی اشباع سینتیکی آنزیم به شکل یک تابع سیگموئیدی است که خاص سیستم های آنزیمی متعاون با تعاون مثبت می باشد. در غلظتهای بالاتری از سوبسترا، تغییر بنای فضائی آنزیم بهمراه کاهش مشخصی از تعاون مثبت در مقابل افزایش چشمگیر ثابت سرعت کاتالیزوری آنزیم روی می دهد. شکل چند پله ای منحنی اتصالی آنزیم در حضور 3- ریبونوکلئوتیدهای آزاد نشان دهنده وجود چهار زیر جایگاه پیوندی است که سه زیر جایگاه اول جهت اتصال سه بخش از اولین نوکلئوتید متصل شونده به آنزیم (فسفات، ریبوز و باز) اختصاص یافته است و طریقه اتصال با الگوی منظم 3- فسفات ریبوز باز 5 صورت می گیرد. چهارمین زیر جایگاه اتصالی نیز متعلق به دومین گروه فسفات از دومین نوکلئوتید متصل شوند به آنزیم می باشد. ترتیب برای واحدهای نوکلئوتیدی موجود در ساختمان ‏‎rna‎‏ برخلاف نحوه اتصال 3- ریبونوکلئوتیدهای آزاد به شکل 5-فسفات ریبوز باز 3 صورت می گیرد. نقش کاتالیزوری و ساختمانی اسیدهای آمینه هیستیدین در پیکره آنزیم ریبونوکلئاز لوزالمعده گاز ‏‎(rnase a)‎‏ با استفاده از روشهای مدیفیکاسیون شمیائی واحدهای هیستیدین؛ محاسبه سطح در دسترس اسیدهای آمینه ‏‎(asa)‎‏؛ اسپکتروفلوئورومتری؛ اسپکتروسکوپی ‏‎uv-cd‎‏؛ گرماشنجی رویشی افتراقی ‏‎(dsc)‎‏؛ کروماتوگرافی با کارکرد عالی ‏‎(hplc)‎‏ و همچنین سنجش میزان فعالیت آنزیمی در شرایط بافر تریس‏‎edta-‎‏ (100 میلی مولار تریس؛ ‏‎ph 7/5‎‏؛ 2 میلی مولار ‏‎edta‎‏) و دمای ‏‎37c‎‏ بررسی شده است. مطالعات انجام شده نشان می دهد که از چهار واحد هیستیدین موجود در ساختمان آنزیم تنها سه واحد هیستیدین توسط معرف شیمیایی دی اتیل پیروکربنات ‏‎(depc)‎‏ مدیفاید می شود و هیستیدین چهارم عملا توسط معرف مذکرو قابل دستیابی نمی باشد. به علت عدم امکان استفاده از روابط و معادلات ترمودینامیکی سیستم های پروتئینی بازگشتی که بر پایه ترمودینامیک تعادلی استوار گشته اند تجزیه و تحلیل منحنیهای واسرشتی حرارتی برای سیستم های پروتئینی غیر بازگشتی نیازمند ارائه معادلات جدیدی می باشد که امکان تفکیک یک منحنی واسرشتی حرارتی را به زیر پیک های سازنده آن فراهم می سازد. در چنین شرایطی میتوان تعداد حد واسطهای موجود در روند واسرشتی حرارتی یک پروتئین را مشخص نمود. در اینجا، پایه گذاری و استفاده از چنین معادلاتی درمورد یک سیستم پروتئینی غیر بازگشتی و چند زیر واحدی نظیر هموگلوبین مشخص ساخته است که این پروتئین، طی واسرشتی حرارتی خود از سه حد واسط پایدار گذر می کند.

در این پایان نامه ساختار و عملکرد هموگلوبین پرندگان و پستانداران مورد مطالعه قرار گرفته است. پایداری حرارتی هموگلوبین مرغ ، غاز پاخاکستری ، بوقلمون به عنوان پرنده و انسان ، گاو ،گوسفند و اسب به عنوان پستاندار به شکل همولیزات در 50 ‏‎mm‎‏بافر تریس ‏‎ph7/2‎‏ و ‏‎mm edta‎‏ 1 مورد مطالعه قرار گرفته و با افینیته اکسیژن آنها مقایسه شده است.پایداری حرارتی به کمک روشهای گوناگونی نظیر روبش دمایی و زمانی جذب 280 نانومتر 7 گرماسنجی روبش تفاضلی ‏‎(dsc)‎‏ مطالعه شده است. افینیته اکسیژن از داکسیژناسیون اکسی هموگلوبین حالت ‏‎r‎‏ به داکسی هموگلوبین حالت ‏‎t‎‏با سدیم دی تیونیت بدست آمده است.در این مطالعه اینطور می توان گزارش کرد که هموگلوبین پرندگان نسبت به پستانداران دارای افینیته اکسیژن کمتر، پایداری حرارتی و خود تجمعی بیشتر می باشند.این نتایج بر پایه توالی اسیدهای آمینه ، حضور افکتور، حضور ‏‎hbd‎‏ تفسیر شده اند.میانگین دمای گذار وارونه ، میانگین آبگریزی ، حجم کل واندروالس ، حجم ویژه جزیی و پتانسیل آبپوشی از روی توالی اسیدهای آمینه محاسبه شده اند.هموگلوبین پرندگان دارای آبگریزی، حجم ،تمایل برای تجمع بیشتر و تمایل برای آبپوشی کمتر می باشند.افکتور ، که افینیته اکسیژن را کاهش می دهد،در پرندگان دارای بار منفی بیشتری نسبت به پستانداران است و همچنین جایگاه اتصال افکتور در پرندگان مثبت تر از پستانداران است.پس اتصال افکتور در هموگلوبین پرندگان قوی تر است و این مسئله باعث پایداری بیشتر و افینیته اکسیژن کمتر در همولیزات پرندگان می شود.

سورالن ها دسته ای از ترکیبات هستند که در گونه های مختلفی از گیاهان یافت می شوند. این ترکیبات از زمانهای بسیار قدیم به عنوان عوامل حساس کننده پوست به نور، جهت درمان اختلالات متفاوت پوستی همانند؛ سوریازیس و ویتیلیگو به کار رفته اند. فعالیت بیولوژیکی سورالن ها در وهله اول ناشی از اتصال آنها به اسیدهای نوکلییک به ویژه ‏‎dna‎‏ تحت تابش نور فرابنفش می باشد. در مطالعه حاضر میان کنش بین 8-متوکسی سورالن ‏‎(8-mop)‎‏ و ‏‎dna‎‏ تیموس گوساله، در شرایط تاریکی و به منظور دستیابی به درک دقیق تری از مکانیزم میان کنش آن با ‏‎dna‎‏ مورد بررسی قرار گرفت. روش های کالریمتری و انواع طیف سنجی جهت مطالعه در محدوده وسیعی از نسبت دارو به ‏‎dna‎‏ به کار گرفته شد. تمامی آزمایش ها در بافر تریس 05/0 مولار با ‏‎ph‎‏ برابر 4/7 انجام گرفت. نمودار تغییرات آنتالپی ‏‎( h)‎‏ در برابر نسبت غلظتی داروی تام به ‏‎dna‎‏، که با روش تیتراسیون کالریمتری هم دما ‏‎(itc)‎‏ به دست آمد منحنی دو مرحله ای را نشان می دهد، به طوریکه ابتدا یک روند اندوترمیک ‏‎‎‏‏‎‎‏(گرماگیر) و به دنبال آن روندی اگزوترمیک (گرمازا) مشاهده می شود. پارامترهای پیوندی براساس آنالیز اسکاچارد فرونشانی نشر فلورسانس ‏‎8-mop‎‏ توسط ‏‎dna‎‏ محاسبه شد. نمودار اسکاچارد یک منحنی دو مرحله ای را نشان می دهد که بیانگر وجود دو دسته جایگاه پیوندی برای اتصال ‏‎8-mop‎‏ به ‏‎dna‎‏ است. ثابت اتصال ‏‎(k)‎‏ و حداکثر جایگاه های اتصال ‏‎(n)‎‏ برای دسته جایگاه اول به ترتیب عبارتند از 10*02/5 و 06/0 (یک مولکول دارو به ازای حدودا 8 جفت باز ‏‎dna‎‏) می باشد. میان کنش بیندارو و ‏‎dna‎‏ در سطح دسته جایگاه اول دال بر مکانیزم فروروندگی دارو در غلظت های پایین است که چنین اتصالی همگام با گرماگیری سیستم می باشد. دسته جایگاه پیوندی دوم ماهیت متفاوتی است و در غلظت های بالاتر ‏‎8-mop‎‏ اشغال می شود به گونه ای که این اتصال از روند گرمازا برخوردار است. در این مطالعه تعیین ماهیت دسته جایگاه پیوندی دوم توسط روش های متعددی انجام گرفته است. تغییرات جذب ‏‎dna‎‏ در 260 نانومتر متعاقب افزودن ‏‎‎‏‏‎‎‏‏‎‎ ‏‎8-mop‎‏ یک روند کاهش غیر خطی را با حداقلی در نسبت 4 تا 6 مول داروی تام به هر مول نوکلیوتید ‏‎dna‎‏ نشان داد. این کاهش احتمالا به خاطر فشردگی در ساختار ‏‎dna‎‏ است که با روند گرمازای مشاهده شده در نمودار ‏‎itc‎‏ ثابت می شود. افزایش دمای ذوب ‏‎dna(tm)‎‏ به میزان 3 درجه سانتیگراد نیز با روش اسپکتروسکوپی رویش دمایی ‏‎(tts)‎‏ بدست آمد دلیل موکد دیگری بر این مسیله است. در ضمن رفتار مهار غیر رقابتی متوکسالن بر میان کنش ‏‎dna‎‏-اتیدیوم برماید ‏‎(et)‎‏ که توسط روش فلوریمتری بررسی شد، باز بر اتصال غیر فروروندگی ‏‎8-mop‎‏ در غلظت های بالا به ‏‎dna‎‏ دلالت می نماید. طیف های دو رنگ نمایی دورانی ‏‎dna,(cd)‎‏ در حضور ‏‎8-mop‎‏ نیز اتصال غیر فروروندگی دارو را در مقایسه با میان کنش ‏‎dna-et‎‏ ثابت می نماید. در نتیجه، بر طبق نتایج به دست آمده و نیز داده های گزارش شده توسط دیگر محققین در گذشته؛ متوکسالن در شرایط تاریکی، در غلظت کم به صورت فرورونده به ‏‎dna‎‏ متصل می شود که روندی گرماگیر است اما در نسبت های بالاتر ‏‎[drug]t/[dna]‎‏، مکانیسم اتصال آن تغییر می نماید و عمدتا به خغارج ‏‎dna‎‏ پیوند می گرد که چنین اتصالی احتمالا باعث مقداری فشردگی در ساختار ‏‎dna‎‏ می شود.