جداسازی و شناسایی باکتریهای آنتاگونیست بعنوان بخشی از ذخایر زیستی از منابع طبیعی بدلیل قابلیت استفاده در کنترل بیولوژیک و فراهم آوردن شانس استحصال متابولیت های مهاری باارزش با قابلیت استفاده در برنامه های طراحی و تولید داروهای ضدقارچی جدید، توجه محققین را بیش از هر زمان دیگر به خود معطوف داشته است. تحقیق حاضر با هدف جداسازی و شناسایی باکتری های مهار کننده رشد برخی از قارچ های بیماریزا در انسان و حیوانات شامل درماتوفیت ها و ساپروفیت های دارای اهمیت پزشکی انجام گرفته است. تعداد 148 نمونه خاک مناطق مختلف تهران بصورت نقطه ای در مجاورت آسپرژیلوس نایجر در محیط کشت جامد گلوکز- عصاره مخمر (gy) از نظر حضور باکتریهای مهاری مورد غربالگری قرار گرفتند. باکتری های موجود در خاک های مهاری از طریق کشت سوسپانسیون خاک در پلیت های gy جداسازی و انتقال به پلیت های جدید، جداسازی و خالص شدند. باکتریهای مهاری از طریق روش غربالگری کشت خطی بر روی محیط gy در مجاورت قارچ آسپرژیلوس نایجر، شناسایی شدند. تاثیر مهاری این باکتریها بر رشد سایر قارچ های مورد بررسی به روش کشت خطی در محیط gy مورد ارزیابی قرار گرفت. باکتریهای دارای بیشترین تاثیر مهاری با استفاده از روش pcr و تکثیر ژن 16s rrna و مقایسه توالی های ژنومی با توالی های شناخته شده موجود در gene bank شناسایی گردیدند. بر اساس نتایج بدست آمده، از میان 148 نمونه خاک مورد بررسی، تعداد 36 نمونه قادر به مهار رشد قارچ بودند. از کشت 36 نمونه خاک با خاصیت مهارکنندگی قارچ، 97 باکتری مختلف جدا گردید که 16 ایزوله قادر به مهار رشد بالا، 32 ایزوله قادر به مهار رشد متوسط تا ضعیف و 49 ایزوله قادر به مهار رشد قارچ نبودند. بر اساس آنالیز توالی ژن 16s rrna باکتریهای با مهار رشد بالا بصورت آسینتوباکتر بومانی (1 استرین)، باسیلوس سابتیلیس (5 استرین)، باسیلوس آمیلولیکوفاسینس (6 استرین)، باسیلوس والیسمورتیس (2 استرین)، سودوموناس کلرورافیس (1 استرین) و اکتینومیست (1 استرین) شناسایی گردیدند. نتایج حاصل از کشت باکتریهای فوق در مجاورت قارچ های مورد بررسی شامل آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نایجر، میکروسپوروم کانیس، میکروسپوروم جیپسئوم، ترایکوفایتون منتاگروفایتس، ترایکوفایتون روبروم، ترایکوفایتون تونسورانس، ترایکوفایتون ویولاسئوم، اپیدرموفایتون فلوکوزوم، فوزاریوم مونیلی فورم و پنیسیلیوم با استفاده از روش کشت خطی در محیط جامد gy نشان داد که تمامی باکتریهای مذکور قادر به مهار معنی دار رشد کلیه قارچ های مورد بررسی در سطوح مختلف از 10 تا 100 درصد بودند. در مجموع، باکتریهای مهاری تاثیر ضدقارچی بیشتری برعلیه درماتوفیت ها در مقایسه با قارچهای رشته ای داشتند. در میان باکتریهای مورد بررسی، سودوموناس کلرورافیس بیشترین تاثیر ضدقارچی را از خود نشان داد که در کشت مایع در محیط gy براث از حداقل 34/58 درصد برای قارچ پنیسیلیوم تا حداکثر 88/97 درصد برای ترایکوفیتون تونسورانس متغییر بود. باکتریهای مهاری شناسایی شده در تحقیق حاضر میتوانند بعنوان کاندیدی مناسب جهت کنترل بیولوژیک قارچهایی نظیر آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نایجر و فوزاریوم مونیلیفورم و همچنین استخراج، شناسایی و بکارگیری متابولیت های مهاری آنها در طراحی و تولید داروهای ضدقارچی مورد استفاده قرار گیرند.

سیکلوپیازونیک اسید از نظر ساختمانی یک اندول تترامیک اسید سمی است که توسط گونه های قارچی مختلف از جنس های پنی سیلیوم و آسپرژیلوس تولید میگردد. در تحقیق حاضر نقش ژنهای vea، laeaو aflr در تعیین ویژگیهای مورفولوژیک و تولید سیکلوپیازونیک اسید در ایزوله های آسپرژیلوس فلاووس جداسازی شده از نمونه های خاک مزارع پسته بررسی گردید. ایزوله های آسپرژیلوس فلاووس با استفاده از محیط های کشت اختصاصی نظیر آسپرژیلوس فلاووس-پارازیتیکوس آگار و بوسیله تلفیقی از ویژگیهای مورفولوژیک و الگوی تولید مایکوتوکسین مورد تایید قرار گرفتند. ایزوله ها بوسیله روش tip culture در محیط کشت عصاره مخمر- سوکروز در دمای 28 درجه سانتیگراد بمدت 4 روز کشت داده شدند و حضور سیکلوپیازونیک اسید بصورت لکه های مرئی ارغوانی- بنفش پس از اسپری کردن پلیت کروماتوگرافی لایه نازک (tlc) با معرف ارلیش تایید گردید. مقادیر سیکلوپیازونیک اسید و آفلاتوکسین تولید شده توسط ایزوله ها با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا) hplc( اندازه گیری شد. میزان بیان ژنهای vea، laeaو aflr در 4 ایزوله شامل مولد سیکلوپیازونیک اسید و آفلاتوکسین، مولد سیکلوپیازونیک اسید و غیر مولد آفلاتوکسین، غیر مولد سیکلوپیازونیک اسید و مولد آفلاتوکسین و غیر مولد سموم مذکور توسط روش pcr time real بر روی rna ژنومی و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی هر ژن بررسی شد. بر اساس نتایج بدست آمده، در مجموع 60/56 درصد از ایزوله های آسپرژیلوس فلاووس قادر به تولید همزمان سیکلوپیازونیک اسید و آفلاتوکسین b1و 09/15 درصد غیر مولد سیکلوپیازونیک اسید و آفلاتوکسین b1بودند. 77/3 درصد و 52/24 درصد ایزوله ها به ترتیب قادر به تولید سیکلو پیازونیک اسید و آفلاتوکسین b1به تنهایی بودند. بالاترین میزان غلظت سیکلوپیازونیک اسید و آفلاتوکسین b1 تولید شده توسط 53 ایزوله آسپرژیلوس فلاووس مورد بررسی به ترتیب برابر 85/403 و 28/7446 میکروگرم در گرم وزن خشک قارچ تعیین گردید. نتایج حاصل از بررسی توام تولید سیکلو پیازونیک اسید، آفلاتوکسین b1 و اسکلروتیا در ایزوله های مورد مطالعه نشان داد که 40/43 درصد از ایزوله های آسپرژیلوس فلاووس مولد سیکلوپیازونیک اسید، آفلاتوکسین b1 و اسکلروتیا بودند (گروه i) و 21/13 درصد از آنها در حالیکه سیکلوپیازونیک اسید و آفلاتوکسین b1را تولید می کردند قادر به تولید اسکلروتیا نبودند (گروه ii). میزان 43/9 درصد از ایزوله ها منحصرا مولد آفلاتوکسین b1 و اسکلروتیا (گروه iv) و 09/15 درصد منحصرا مولد آفلاتوکسین (گروهvi ) بودند. تولید تنها سیکلو پیازونیک اسید و اسکلروتیا در 77/3 درصد ایزوله ها (گروه vii) گزارش گردید و هیچیک از ایزوله های غیرمولد سموم سیکلوپیازونیک اسید و آفلاتوکسین b1که شامل 09/15 درصد موارد بودند اسکلروتیا تولید نکردند (گروه viii). هیچ ایزوله منحصرا مولد سیکلوپیازونیک اسید (گروه iii) و یا اسکلروتیا (گروه v) گزارش نگردید. آنالیز آماری نتایج به دست آمده در رابطه با تولید سیکلوپیازونیک اسید و آفلاتوکسین b1 با استفاده از روش آنالیز واریانس یک طرفه (anova) نشان داد که تفاوت تولید سموم مذکور در میان ایزوله های آسپرژیلوس فلاووس مورد مطالعه در برخی موارد در سطح کمتر از 05/0 معنی دار بود که خود نشان دهنده تنوع ژنتیکی ایزوله های مذکور از نظر تولید سم میباشد. نتایج بدست آمده از آنالیز بیان ژن های vea، laea و aflr در ایزوله های مولد و غیر مولد سم آسپرژیلوس فلاووس نشان داد که هیچگونه ارتباط معنی داری بین فعالیت ژنهای مذکور و تولید سیکلوپیازونیک اسید و اسکلروتیا وجود ندارد. با توجه به نتایج بدست آمده در تحقیق حاضر، ایزوله های مولد سیکلوپیازونیک اسید و آفلاتوکسین جداسازی شده از خاک بعنوان یک تهدید بالقوه بهداشت عمومی مطرح میباشند. نهایتا، بررسی تعداد بیشتری از استرین های مولد و غیر مولد سم از منابع محیطی مختلف جهت تایید دقیق نقش ژن های مذکور و سایر ژنهای مسیر بیوسنتزی آفلاتوکسین و سیکلوپیازونیک اسید در تعیین ویژگیهای مورفولوژیک و الگوی تولید مایکوتوکسین جمعیت های آسپرژیلوس فلاووس توصیه میگردد. واژه های کلیدی: آسپرژیلوس فلاووس، سیکلوپیازونیک اسید ،آفلاتوکسین ،اسکلروتیا، vea، aeal، aflr

در مطالعه حاضر، تنوع ژنتیکی و الگوهای تولید مایکوتوکسین استرین های آ. فلاووس جدا شده از هوا ( فضا های داخلی و خارجی)، سطوح و خاک های پنج بیمارستان شهر خرم آباد در جنوب غربی ایران مورد بررسی قرار گرفت. از مجموع 707 کلنی قارچی، گونه های پنی سیلیوم (14/29%)، کلادوسپوریوم (04/24%)، آسپرژیلوس (65/20%)، فوزاریوم (05/9%)، آلترناریا (96/3%)، رودوتورولا(69/1%) و کریپتوکوکوس نئوفورمنس (7/.%) از هوا (فضاهای داخلی و خارجی) و سطوح تمامی بیمارستان ها به وسیله روش پلیت گذاری بدست آمد. فراوان ترین گونه ها، آ. نایجر و به دنبال آن آ. فلاووس، آ. اوکراسئوس، آ. تاماری و آ. ترئوس بود. اگرچه، آسپرژیلوس و پنی سیلیوم برای بیماران بستری در بیمارستان ها، به عنوان پاتوژن های مولد مایکوتوکسین و آلرژن ها، تهدید کننده می باشند، جدا نمودن قارچ های غیر معمول در محیط های بیمارستانی مانند ک. نئوفورمنس و ا. شنکئی، نشانگر روبرو شدن با خطرات جدید بهداشت عمومی بوده و بنابراین پیشنهاد روش های جدید برای پایش و کنترل تماس با کونیدیای قارچ های هوابرد ضروری می باشد. از مجموع 146 کلنی آسپرژیلوس، 63 جدایه با استفاده از ترکیب معیار های ریخت شناسی کلنی ها، میکروسکوپی و الگوهای مایکوتوکسین، به عنوان آ. فلاووس شناسایی گردید و هیچگونه آ. پارازیتیکوس جدا نگردید. بر پایه آنالیز کروماتوگرافی کشت های قارچی بر روی محیط آبگوشت عصاره ی مخمر – سوکروز ، به وسیله روش کشت در نوک سمپلر به ترتیب، تقریباً 10%، 45% و 40% جدایه های آ.فلاووس، تولید آفلاتوکسین b1 (afb1)، سیکلوپیازونیک اسید (cpa) و اسکلروتیا نمودند. جدایه ها بر پایه تولید afb1 و cpa به چهار کموتایپ طبقه بندی گردید. اغلب آنها (5/55%) به کموتایپ iv که شامل استرین های غیر مولد مایکوتوکسین بود، تعلق داشت. الگوهای چند شکلی dna تکثیر شده تصادفی (rapd) به وسیله ترکیب چهار آغازگر انتخابی مورد استفاده برای بررسی ارتباطات ژنتیکی 16 استرین سم زا و غیر سم زا استفاده گردید. نتایج دندروگرام تشکیل دو خوشه جداگانه 1و 2 را برای آ. فلاووس شامل استراین های سم زا و غیر سم زا، با یک پراکندگی تصادفی نشان داد. نتایج ما بر پایه تنوع ژنتیکی جدایه های آ. فلاووس نشان داد اگر چه الگوهای rapd به تنهائی قادر به افتراق جدایه های مولد وغیر مولد آفلاتوکسین نمی باشد، ابزاری موثر و نوید دهنده جهت تعیین تنوع ژنتیکی درون گونه ای جمعیت های آ. فلاووس از محیط های بیمارستانی است. جدایه های آ. فلاووس مولد afb1 و cpa بدست آمده، می توانند به علت دارا بودن توانایی اثر بر افراد حساس به صورت مستقیم یا غیر مستقیم، به عنوان یک منبع بالقوه عفونت های بیمارستانی مطرح باشند. در بررسی حضور ژن های afld ، aflo ، aflp و aflq درگیر در مسیر بیوسنتز آفلاتوکسین، با هدف تفکیک جدایه های مولد و غیر مولد آفلاتوکسین با استفاده از روشpcr به همراه نسخه برداری معکوس rt-pcr، نتایج ما نشان داد اگر چه به علت عدم بیان چهار ژن فوق در ایزوله های مولد ضعیف آفلاتوکسینb1 با استفاده از روش rt-pcrنمی توان ایزوله های مولد و غیر مولد آفلا توکسین را از هم افتراق داد،اما چون هر چهار ژن مورد بررسی در هیچ یک از ایزوله های آ.فلاووس غیر مولد آفلا توکسینb1بیانی نداشتند ،تکنیک rt-pcr می تواند بدون ایجاد نتایج مثبت کاذب ،ایزوله های غیر سم زا را به شکل 100 در صد مشخص نماید.

آفلاتوکسین ها یک گروه پلی کتاید مشتق از فورانوکومارین ها هستند که توسط تعدادی از گونه های آسپرژیلوس تولید می شوند. در تحقیق حاضر اثر ممانعت کنندگی کورکومین، کوئرستین، اوگنول و لوتئولین بر رشد قارچ و در تولید آفلاتوکسین در آسپرژیلوس فلاووس با تاکید بر بیان ژنهای aflr, ver1,nor1, nada و cypa مورد بررسی قرار گرفت. اسپور های آسپرژیلوس فلاووس بوسیله روش tip culture در محیط کشت عصاره مخمر- سوکروز حاوی غلظت های معینی از مواد مورد نظر در دمای 28 درجه سانتیگراد بمدت 4 روز کشت داده شدند و وجود آفلاتوکسین b1 بصورت لکه های فلورسانس آبی رنگ کروماتوگرافی لایه نازک (tlc) زیر نور uv مشاهده شد. مقادیر آفلاتوکسین b1 تولید شده تحت تاثیر غلظت های مختلف مواد مورد آزمایش با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (hplc) اندازه گیری شد. میزان بیان ژنهای aflr, ver1,nor1, nada و cypa در آسپرژیلوس فلاووس مجاور شده با غلظت های 250 و 1000 میکروگرم در میلی لیتر کورکومین و غلظت های 5/62 و 125 میلی گرم در میلی لیتر اوگنول توسط روش pcr real time بر روی rna ژنومی و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی هر ژن بررسی شد. در تحقیق حاضر پس از مجاور سازی اسپورهای آسپرژیلوس فلاووس با کورکومین و اوگنول با غلظتهای ذکر شده در مدت 3 روز، مشخص شد که کورکومین در غلظت 500 میکروگرم در میلی لیترو اوگنول در غلظت 5/62 میکروگرم در میلی لیتر تا 50% باعث مهار رشد و کاهش تولید آفلاتوکسین در قارچ آسپرژیلوس فلاووس می گردند. نتایج حاصل از بررسی بیان ژن نشان داد که تمام ژن های مورد مطالعه در خوشه ژنی بیوسنتز آفلاتوکسین بطور قابل توجهی (log<?1.0) down regulate شده اند که به طبع آن نشان دهنده کاهش سطوح mrna می باشد که بیشترین اثر ممانعت کنندگی مربوط به ژن ver1 تحت تاثیر غلظت 125 میلی کرم در میلی لیتر اوگنول در آسپرژیلوس فلاووس بوده است و کمترین اثر ممانعت کنندگی مربوط به ژن aflr تحت تاثیر غلظت های مختلف کورکومین و اوگنول بوده است. آنالیز آماری نتایج به دست آمده در رابطه با مهارتولید آفلاتوکسین b1 با استفاده از روش آنالیز واریانس یک طرفه (anova) نشان داد که تفاوت کاهش بیان ژن در غلظت های کورکومین و اوگنول نسبت به نمونه استاندارد در بیشتر موارد در سطح کمتر از 05/0 معنی دار بوده است. نتایج حاصل از بررسی اثر سایتوتوکسیسیتی اوگنول و کورکومین روی سلول های نوروگلیا، تاثیر ضعیف اوگنول را روی فعالیت متابولیکی سلول ها نشان داد و با توجه به قدرت آنتی اکسیدانی بالای اوگنول با توجه به نتایج تست frap، مشخص شد که اوگنول ماده مناسبی برای استفاده جهت کنترل تولید آفلاتوکسین نسبت به کورکومین می باشد.

در این مطالعه با استفاده از تلفیق روش مورفولوژیک، تعیین توالی نواحی its1/its4 و تکنیک ملکولی rflp، گونه های آسپرژیلوس موجود در هوای مناطق 22 گانه تهران شناسایی گردیدند. نمونه برداری از هوای تهران به روش پلیت باز انجام گرفت. شایعترین عوامل قارچی جدا شده به ترتیب فراوانی شان متعلق به جنس های : آسپرژیلوس (3/31%)، کلادوسپوریوم (1/22%)، پنی سیلیوم (8/13%) و آلترناریا (2/12%) بودند. با استفاده از تلفیق روش های مورفولوژیک و تعیین توالی نواحی its1/its4، مشاهده شد که آسپرژیلوس های جداسازی شده متعلق به 12 گونه شامل آسپرژیلوس نیجر (30%)، آسپرژیلوس فلاووس (1/19%)، آسپرژیلوس ژاپونیکوس (8/11%)، آسپرژیلوس توبینجنسیس (17%)، آسپرژیلوس آمستلودامی (3/5%)، آسپرژیلوس اوریزه ای (2/5%)، آسپرژیلوس فومیگاتوس (6/4%)، آسپرژیلوس اخراسئوس (3/3%)، آسپرژیلوس ترئوس (6/2%)، آسپرژیلوس فلاویپس (6/2%)، آسپرژیلوس ورسیکالر (2%) و آسپرژیلوس نیدولانس (6/1%) بودند. محصول pcr که با استفاده از پرایمرهای its1/its4بدست آمده بود تحت تاثیر آنزیم های برش دهنده ecor1 و taq1قرار گرفت و مشاهده شد که الگوی قطعات حاصل از اثر آنزیمecor1 در تمامی گونه ها مشابه بوده و ایجاد قطعه 300جفت بازی می کند همچنین مشاهده شد که الگوی قطعات حاصل از اثر آنزیم taq1 در گونه های ترئوس، فلاووس، آمستلودامی، توبینجنسیس، نیجر، ورسیکالر و اوریزه ای بسیار مشابه می باشد و تمامی گونه های مذکور قطعات سه باندی حدود 60 جفت باز، 160 جفت باز و 210جفت بازی تولید می کنند در حالیکه الگوی قطعات حاصل از اثر آنزیم taq1 در سایر گونه ها متفاوت می باشد بطوریکه در آسپرژیلوس فلاویپس 4 قطعه با اندازه های حدود 60، 90، 150 و 190 جفت باز، در آسپرژیلوس اخراسئوس 2 قطعه با اندازه های حدود 60 و 180 جفت باز، در آسپرژیلوس ژاپونیکوس سه قطعه با اندازه های حدود 60، 120 و 220 جفت باز، در آسپرژیلوس نیدولانس سه قطعه با اندازه های حدود 60، 180 و 200 جفت باز و در آسپرژیلوس فومیگاتوس دو قطعه با اندازه های حدود 80 و 140 جفت باز ایجاد گردید. نتایج بدست آمده نشان داد که آنزیم taq1 با ایجاد 6 الگوی باندی متفاوت منجر به افتراق 5 گونه آسپرژیلوس فلاویپس،آسپرژیلوس اخراسئوس، آسپرژیلوس ژاپونیکوس، آسپرژیلوس نیدولانس و آسپرژیلوس فومیگاتوس از یکدیگر و سایر گونه ها می گردد. با توجه به نقش بارز آسپرژیلوسها در ایجاد انواع بیماریها نظیر آسپرژیلوزیس مهاجم، آسپرژیلوما و...، شناسایی پراکندگی و شیوع گونه های غالب، حائز اهمیت است و راه اندازی یک سیستم تشخیص ملکولی بر اساس تکنیکهایی نظیر تعیین توالی نوکلئوتیدی نظیر ناحیه its1/4 و rflp، اطلاعات جامعی در خصوص تعیین الگوی جمعیتی این جنس قرار می دهد که می تواند در برنامه ریزیهای موثر با هدف جلوگیری و کنترل عفونتهای ناشی از گونه های آسپرژیلوس راهگشا باشد. کلید واژه: گونه های آسپرژیلوس، شناسایی مورفولوژیک، تعیین توالی، تکنیک ملکولی rflp.

چکیده: در تحقیق حاضر دسته بندی و تنوع ژنتیکی 55 ایزوله فوزاریوم جدا سازی شده از نمونه های ذرت (42 ایزوله) و گندم (13ایزوله) از مناطق جغرافیایی مختلف ایران بررسی گردید. کلیه ایزوله ها به وسیله کلید های مورفولوژیک مورد شناسایی و با استفاده از تعیین توالی ژن tef-1? تائید شدند. ایزوله های شناسایی شده براساس تعیین توالی ژن tef-1? شامل فوزاریوم ورتیسیلوئیدس (26 ایزوله، 3/47%) ، فوزاریوم پرولیفراتوم 26 (ایزوله3/47%)، فوزاریوم فوجیکورویی (یک ایزوله، 8/1%)، فوزاریوم ردولنس (یک ایزوله، 8/1%) و فوزاریوم نیگامایی (یک ایزوله، 8/1%) بودند. ایزوله های شناسایی شده براساس دندروگرام حاصل از آنالیز توالی ژن tef-1? در سه گروه طبقه بندی شدند. ایزوله های فوزاریوم پرولیفراتوم و فوزاریوم فوجیکورویی در گروه i ، ایزوله های فوزاریوم ورتیسیلوئیدس و فوزاریوم نیگامایی در گروه ii و فوزاریوم ردولنس در گروه iii جای گرفتند. این اولین گزارش فوزاریوم ردولنس از ایران است که از نمونه گندم جدا شد. همچنین شناسایی توانایی تولید فومونیسین b1 توسط فوزاریوم های جدا سازی شده با استفاده از روش های کروماتوگرافی لایه نازک و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا مورد بررسی قرار گرفت. 22 ایزوله از 55 ایزوله (40%) فومونیسین b1 تولید کردند که محدوده تولید آنها از 4/230 تا 9565 میکروگرم در میلی لیتر ارزیابی شد. ایزوله هایی مولد فومونیسین b1 شامل فوزاریوم ورتیسیلوئیدس (8 ایزوله، 5/14%)، فوزایوم پرولیفراتوم (13، 7/23%)، فوزاریوم فوجیکورویی (1 ایزوله،8/1 %)، فوزاریوم نیگامایی(1 ایزوله، 8 /1%) بودند. بیشترین میزان فومونیسین توسط فوزاریوم ورتیسیلوئیدس و بعد از آن فوزاریوم پرولیفراتوم تولید شد. تنوع ژنتیکی 55 ایزوله فوزاریوم با استفاده از نشانگر های پلی مورفیسم طول قطعات تکثیر شده(aflp) مورد ارزیابی قرار گرفت و گروه بندی ایزوله ها با استفاده از ضریب تشابه دایس و الگوریتم upgma صورت گرفت. براساس 54 نشانگر چند شکل، 55 ایزوله فوزاریوم در هفت گروه انگشت نگاری مجزا (a-g)قرار گرفتند که گروه انگشت نگاری a با 20 عضو بزرگترین گروه ژنتیکی و بقیه گروه ها بین 2 تا 10عضو را شامل شدند. بر اساس نتایج تجزیه واریانس مولکولی (amova) تنوع ژنتیکی جمعیت ها بیشتر از درون جمعیت ها ارزیابی شد که ناشی ازعواملی مانند جهش و مهاجرت ژن یا ژنوتیپ می باشد. نتایج حاصل از دندروگرام تعیین توالی ژن tef-1? ایزوله ها را در سه گروه در حالیکه aflp در 7 گروه ژنتیکی طبقه بندی نمود، علت را می توان در بررسی تمام ژنوم و ایجاد قطعات مختلف dna توسط تکنیک aflp نسبت داد. قرار گرفتن ایزوله های مختلف مولد فومونیسین در گروههای متفاوت ناشی از وجود ارتباط گونه ها و سوش های جدا شده با تولید فومونیسین می باشد در حالیکه قرار گرفتن ایزوله های مختلف در یک گروه هر گونه ارتباط بین ایزوله ها و منشاء جغرافیایی را رد می نماید. واژگان کلیدی: فوزاریوم، فومونیسین، تعیین توالی ژن tef-1?، نشانگر aflp

بیش از 80 جنس قارچ های آلرژی زا تشخیص داده شده اند که از مهمترین آنها آلترناریا، کلادوسپوریوم، پنیسیلیوم، کوروولاریا، اولوکلادیوم و آسپرژیلوس می باشد. از مهمترین آلرژن های آلترناریا میتوان به alta1 اشاره کرد که توسط قارچ آلترناریا آلترناتا تولید میشود. هدف از این مطالعه بررسی ژن alt a 1 در آلترناریا و جنس های آلرژی زای وابسته و ارزیابی نقش پروتئین حاصل از فیلتر کشت در بروز آسم و آلرژی در مبتلایان به اختلالات دستگاه تنفس تحتانی می باشد. در این بررسی جداسازی alt a1 از سویه های استاندارد قارچی شامل آلترناریا آلترناتا و جنس های وابسته با استفاده از روش الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات پلی آکریل آمید و ایمنوبلاتینگ انجام شد. همچنین ﺑـﻪ ﻣﻨﻈـﻮر ﺑﺮرﺳـﯽ و ﻣﻘﺎﯾـﺴﻪ ﻣﯿـﺰان mrna ژن alt a 1 در آ.آلترناتا و جنس های وابسته توسط روش real time pcr، ﭘﺲ از جداسازی میسلیوم های قارچی rna ﮐـﻞ اﺳـﺘﺨﺮاج و ﭘـﺲ از ﺳـﻨﺘﺰ cdna، ﺗﻐﯿﯿﺮات ﻣﯿﺰان ﺑﯿﺎن ژن ﻫﺎی ﻣﺬﮐﻮر اﻧﺪازه ﮔﯿﺮی ﺷﺪ. 202 بیمار مبتلا به آلرژی در محدوده سنی 18 تا 83 سال، آزمون پوستی به روش ایجاد خراش (prick test) نسبت به آلرژن استاندارد آلترناریا آلترناتا انجام شد. همچنین ارزیابی سرم بیماران ازنظر میزان ige اختصاصی نسبت به طیف وسیعی از آلرژنها توسط سیستم immunocap انجام شد نتایج تکنیک الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات پلی آکریل آمید ژل و ایمنوبلاتینگ نشان داد که پروتئین alt a 1 درآ.آلترناتا، ا. بوتریوزوم و ا چارتاروم به شدت با سرم پلی کلونال خرگوش ضد alt a 1 واکنش نشان دادند، در حالی که گونه هایک. لوناتا. ک. کلادوسپوریوئیدس ،ا. نیگروم، پ. کرایزوژنوم و آ. فومیگاتوس اتصال به باند پروتئینی خاص ضدalt a 1 را نشان نداند. نتایج real time pcr نشان داد که بیشترین میزان سطح ژنalt a 1 درآلترناریا آلترناتا، اولوکلادیوم، استمفیلیوم و کورولاریا به ترتیب می باشند. از 202 بیمار آسمی مورد مطالعه 49 نفر (24/75 درصد) نسبت به آ.آلترناتا دارای آزمون پوستی مثبت نشان دادند. واکنش به سوسک، علفهای هرز، قارچ آ. آلترناتا و گربه به ترتیب 44، 32، 25 و 12 درصد بود. نتایج حاصل از ارزیابی ige اختصاصی ضد آ. آلترناتا نشان داد که در 25 درصد بیماران آسم و آلرژیک به عنوان قارچ قابل اهمیت مورد توجه می باشد. همچنین منابع آلرژن غیر قارچی نقش اصلی و عمده را در بروز و شیوع آسم در جمعیت مورد مطالعه نشان دادند. نتیجه آنکه، به دلیل واکنش متقاطع با گرده و عوامل زیست محیطی،گردهها منابع آلرژن اصلی در جمعیت افراد آتوپیک بودند و با توجه به قابل اهمیت بودن قارچ آلترناریا در بیماران مبتلا به آسم و آلرژیک لذا بررسی آلرژن های دیگر آ.آلترناتابه غیرازalt a 1 نیزدارای اهمیت ایمونولوژیک و بالینی می باشد.

در مطالعه حاضر، تنوع ژنتیکی و روابط فیلوژنی گونه های آسپرژیلوس جداسازی شده از هوای تهران با استفاده از روش مولکولی تکثیر تصادفی dna چندشکلی (rapd-pcr)مورد بررسی قرار گرفت. 38 ایزوله از 12 گونه آسپرژیلوس، شامل 11 ایزوله از آسپرژیلوس نایجر، 7 ایزوله از آسپرژیلوس فلاووس، 4 ایزوله از آسپرژیلوس ژاپونیکوس، 5 ایزوله از آسپرژیلوس توبینجنسیس، 4 ایزوله از آسپرژیلوس اوخراسئوس و 1 ایزوله از هر یک از گونه های آسپرژیلوس نیدولانس، آسپرژیلوس آمستلودامی، آسپرژیلوس اوریزا، آسپرژیلوس ورسیکالر، آسپرژیلوس ترئوس، آسپرژیلوس فلاویپس و آسپرژیلوس فومیگاتوس، بر روی محیط سابورو دکستروز آگار کشت داده شدند و سپس استخراج dna انجام گردید ¬و¬¬ جهت تکثیر قطعات ژنی با استفاده از تکنیک rapd-pcr، از 11 آغازگر استفاده گردید. 7 آغازگر pm1،opw-04، opw-05، p160، p54، p10، opa14 قادر به تولید قطعات بیشتری بوده و از آغازگرهای opa20 opa17،opa10، opa117 پاسخ مناسبی دریافت نشد. با استفاده از 7 پرایمر تصادفی، 1052 قطعه ژنی تکثیرگردید. آغازگرpm1 بیشترین قطعه و opa14 کمترین قطعه را ایجاد نمودند و میانگین قطعات ایجاد شده از 150 تا 2500 جفت باز بوده است. قطعات ژنی تولید شده توسط هر آغازگر شامل: pm1 (181 قطعه)، opw04 (176 قطعه)، p10 (156قطعه)، p160 (147قطعه)، opw05 (145قطعه)، p54 (142قطعه)، opa14 (105 قطعه) بود. به منظور تجزیه و تحلیل داده های حاصل از واکنش rapd-pcr از نرم افزار upgma استفاده گردید و نتایج دندروگرام حاصل از ترکیب 7 آغازگر تشکیل 8 خوشه اصلی برای 12 گونه آسپرژیلوس شامل 38 زیرگونه را نشان داد. ایزوله های آسپرژیلوس نایجر با درصد ¬تشابه 41 درصد، ایزوله های آسپرژیلوس ژاپونیکوس 87 درصد، ایزوله های آسپرژیلوس فلاووس 31 درصد، ایزوله های آسپرژیلوس توبینجنسیس 18 درصد و ایزوله های آسپرژیلوس اوخراسئوس 37 درصد، هرکدام دریک خوشه و آسپرژیلوس نیدولانس، آسپرژیلوس اوریزا و آسپرژیلوس ورسیکالر در یک خوشه جداگانه دارای یک جد مشترک بودند. نتایج نشان دادکه گونه های مورد نظر از الگوی متفاوتی برخوردار بوده و با بررسی الگوی فیلوژنی گونه ها و سوشهای مربوطه، به تنوع ژنتیکی بین و درون گونه ای با استفاده از تکنیک rapd پی برده شد و rapd-pcrبه عنوان تکنیکی سریع، حساس و تجدید پذیر جهت تشخیص گونه های آسپرژیلوس کارایی بالایی داشته و می توان از آن جهت دست یابی به اطلاعات جامع برای برنامه ریزیهای موثر جهت کنترل عفونت های ناشی از آسپرژیلوس ها استفاده نمود.

گونه های آلترناریا بخش مهمی از فلور قارچی موجود در محیط هستند که در همه جا بویژه در هوا، خاک، آب و ترکیبات آلی در حال فساد یافت می شوند. این قارچ ها به عنوان یکی از شایع ترین عوامل ایجاد کننده آلرژی در انسان مطرح بوده و ارتباط نزدیکی با ایجاد آسم و انواع دیگر ازدیاد حساسیت در انسان دارند. از مهمترین آلرژن های آلترناریا پروتئینی به نام alt a1 است که عمدتا توسط آلترناریا آلترناتا تولید میشود. در تحقیق حاضر، توالی ژن alt a1 با هدف بررسی میزان همولوژی ژن مذکور و ارتباط اجدادی 48 ایزوله آلترناریا جداسازی شده از نمونه هوای مناطق 22 گانه شهر تهران شامل آلترناریا آلترناتا (16 ایزوله) ، آلترناریا سولانی (11 ایزوله)، آلترناریا تنوئیسیما (11 ایزوله)، آلترناریا پوری (8 ایزوله) و آلترناریا براسیسیکولا (2 ایزوله) تعیین و مورد مقایسه قرار گرفت. دندروگرام حاصل از آنالیز توالی ژن مذکور نشان داد که گونه ها و ایزوله های آلترناریا در دو شاخه اصلی با 7 و 3 زیر شاخه طبقه بندی گردیدند. قرابت داخل گونه ای بالایی در میان گونه های مورد بررسی گزارش گردید و اکثر ایزوله های مربوط به یک گونه از قرابت بالای 90 درصد برخوردار بودند. اکثر ایزوله های آلترناریا آلترناتا (با 99% قرابت)، آلترناریا سولانی (با 99% قرابت)، آلترناریا تنوئیسیما (با 99% قرابت) و آلترناریا پوری (با 99% قرابت) در زیر شاخه های مربوط به یک گونه قرار گرفتند. هر چند اختلافاتی در جایگاه یک ایزوله آلترناریا پوری taap-3 (با 99% قرابت) با گونه های آلترناتا، سولانی و تنوئیسیما مشاهده گردید. همچنین تفاوتهایی در جایگاه دو ایزوله آلترناریا سولانی شامل taas-3 (با 99% قرابت) با زیر شاخه متعلق به ایزوله ها ی آلترناریا تنوئیسیما و taas-4 (با 99% قرابت) با زیر شاخه متعلق به ایزوله های آلترناریا آلترناتا و آلترناریا تنوئیسیما مشاهده گردید. اکثر ایزوله های آلترناریا آلترناتا و آلترناریا تنوئیسیما در دو زیر شاخه با درصد قرابت 99 و 59 قرار گرفتند و تنها دو سوش آلترناریا آلترناتا شامل taaa-13 و taaa-10 در دو زیر شاخه جدا از هم طبقه بندی شدند. در رابطه با دو ایزوله آلترناریا براسیسیکولا تفاوت چشمگیری در جایگاه فیلوژنیک مشاهده گردید. این ایزوله ها هر یک در زیر شاخه ای مجزا در یکی از شاخه های اصلی قرار گرفتند و میزان قرابت ایزوله taab-1 با ایزوله های متعلق به آلترناریا آلترناتا، آلترناریا سولانی و آلترناریا تنوئیسیما حدود 54% و قرابت ایزوله taab-2با ایزوله های متعلق به الترناریا پوری حدود 99% گزارش گردید. نتایج بدست آمده در تحقیق حاضر اهمیت گونه های آلترناریا را بعنوان یکی از گروه های مهم قارچ های آئروآلرژن مورد تاکید قرار داده و نشان داد که تعیین توالی ژن alt a1 میتواند برای ارزیابی وابستگی اجدادی ایزوله های منعلق به گونه های اصلی آلترناریا بسیار مفید و کارامد باشد. ارزیابی نقش گونه های آلترناریای مورد بررسی در تحقیق حاضر در اتیولوژی آسم و آلرژی در سطح جمعیت توصیه شده و میتواند در اتخاذ راهکارهای موثر کنترل و درمان موارد بیماری های مذکور راهگشا باشد.

کاندیدا آلبیکنس یک قارچ فرصت طلب بیماری زا است که بعنوان عامل طیف گسترده ای از عفونت های قارچی از سطحی تا مهاجم تحت عنوان کاندیدیازیس در افراد مستعد مطرح است. در حال حاضر داروهای ضد قارچی مختلف از جمله فلوکونازول برای درمان کاندیدیازیس مورد استفاده قرار می گیرند. با این وجود استفاده از داروهای شیمیایی مشکلاتی چون بروز اثرات جانبی و ظهور گونه های قارچی مقاوم را به همراه دارد. در تحقیق حاضر، قدرت مهار کنندگی اسانس گیاه زیره سیاه (carum carvi) در جلوگیری از رشد کاندیدا آلبیکنس با استفاده از روش میکرودایلوشن مورد بررسی قرار گرفت. پس از تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی، تاثیر اسانس زیره سیاه بر فاکتورهای بیماری زای این قارچ شامل تولید پروتئیناز، فسفولیپاز، ارگسترول و هیدروفوبیسیته مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین تاثیر اسانس زیره سیاه بر بیان ژن erg6 که یکی از ژن های دخیل در بیوسنتز ارگسترول است با استفاده از تکنیک real time pcr مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بدست آمده نشان داد که غلظت های 5/0% و 1% اسانس زیره سیاه به ترتیب باعث مهار 50% و 90% رشد کاندیدا آلبیکنس شد. هیدروفوبیسیته و میزان چسبندگی مخمر در مجاورت اسانس به میزان 40/55 درصد مهار داشت. اسانس گیاه باعث کاهش معنی دار حدود 50 درصدی در تولید پروتئیناز و فسفولیپاز مخمری در مقایسه با گروه شاهد گردید. در رابطه با مهار بیوسنتز ارگسترول، نتایج نشان داد که تولید ارگسترول در قارچ مجاور شده با اسانس به میزان 68/9 درصد مهار گردید. در نهایت نشان داده شد که مجاورت مخمر با اسانس زیره سیاه باعث کاهش معنی دار بیان ژن erg6 در مقایسه با گروه کنترل می شود. در مجموع نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان داد که اسانس زیره سیاه یک عامل بسیار موثر در مهار رشد و تولید فاکتورهای بیماری زایی کاندیدا آلبیکنس می باشد. لذا می توان اسانس این گیاه را با هدف یک کاندید مناسب در طراحی و تولید داروهای ضدقارچی طبیعی موثر بر علیه کاندیدا مورد مطالعه قرار داد.

جداسازی و شناسایی باکتریهای آنتاگونیست بعنوان بخشی از ذخایر زیستی از منابع طبیعی بدلیل قابلیت استفاده در کنترل بیولوژیک و فراهم آوردن شانس استحصال متابولیت های مهاری باارزش با قابلیت استفاده در برنامه های طراحی و تولید داروهای ضدقارچی جدید، توجه محققین را بیش از هر زمان دیگر به خود معطوف داشته است. تحقیق حاضر با هدف جداسازی و شناسایی باکتری های مهار کننده رشد برخی از قارچ های بیماریزا در انسان و حیوانات شامل درماتوفیت ها و ساپروفیت های دارای اهمیت پزشکی انجام گرفته است. تعداد 148 نمونه خاک مناطق مختلف تهران بصورت نقطه ای در مجاورت آسپرژیلوس نایجر در محیط کشت جامد گلوکز- عصاره مخمر (gy) از نظر حضور باکتریهای مهاری مورد غربالگری قرار گرفتند. باکتری های موجود در خاک های مهاری از طریق کشت سوسپانسیون خاک در پلیت های gy جداسازی و انتقال به پلیت های جدید، جداسازی و خالص شدند. باکتریهای مهاری از طریق روش غربالگری کشت خطی بر روی محیط gy در مجاورت قارچ آسپرژیلوس نایجر، شناسایی شدند. تاثیر مهاری این باکتریها بر رشد سایر قارچ های مورد بررسی به روش کشت خطی در محیط gy مورد ارزیابی قرار گرفت. باکتریهای دارای بیشترین تاثیر مهاری با استفاده از روش pcr و تکثیر ژن 16s rrna و مقایسه توالی های ژنومی با توالی های شناخته شده موجود در gene bank شناسایی گردیدند. بر اساس نتایج بدست آمده، از میان 148 نمونه خاک مورد بررسی، تعداد 36 نمونه قادر به مهار رشد قارچ بودند. از کشت 36 نمونه خاک با خاصیت مهارکنندگی قارچ، 97 باکتری مختلف جدا گردید که 16 ایزوله قادر به مهار رشد بالا، 32 ایزوله قادر به مهار رشد متوسط تا ضعیف و 49 ایزوله قادر به مهار رشد قارچ نبودند. بر اساس آنالیز توالی ژن 16s rrna باکتریهای با مهار رشد بالا بصورت آسینتوباکتر بومانی (1 استرین)، باسیلوس سابتیلیس (5 استرین)، باسیلوس آمیلولیکوفاسینس (6 استرین)، باسیلوس والیسمورتیس (2 استرین)، سودوموناس کلرورافیس (1 استرین) و اکتینومیست (1 استرین) شناسایی گردیدند. نتایج حاصل از کشت باکتریهای فوق در مجاورت قارچ های مورد بررسی شامل آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نایجر، میکروسپوروم کانیس، میکروسپوروم جیپسئوم، ترایکوفایتون منتاگروفایتس، ترایکوفایتون روبروم، ترایکوفایتون تونسورانس، ترایکوفایتون ویولاسئوم، اپیدرموفایتون فلوکوزوم، فوزاریوم مونیلی فورم و پنیسیلیوم با استفاده از روش کشت خطی در محیط جامد gy نشان داد که تمامی باکتریهای مذکور قادر به مهار معنی دار رشد کلیه قارچ های مورد بررسی در سطوح مختلف از 10 تا 100 درصد بودند. در مجموع، باکتریهای مهاری تاثیر ضدقارچی بیشتری برعلیه درماتوفیت ها در مقایسه با قارچهای رشته ای داشتند. در میان باکتریهای مورد بررسی، سودوموناس کلرورافیس بیشترین تاثیر ضدقارچی را از خود نشان داد که در کشت مایع در محیط gy براث از حداقل 34/58 درصد برای قارچ پنیسیلیوم تا حداکثر 88/97 درصد برای ترایکوفیتون تونسورانس متغییر بود. باکتریهای مهاری شناسایی شده در تحقیق حاضر میتوانند بعنوان کاندیدی مناسب جهت کنترل بیولوژیک قارچهایی نظیر آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نایجر و فوزاریوم مونیلیفورم و همچنین استخراج، شناسایی و بکارگیری متابولیت های مهاری آنها در طراحی و تولید داروهای ضدقارچی مورد استفاده قرار گیرند

کاندیدیازیس عفونت پوست، حفره دهان و مری، دستگاه معده ای _روده ای، واژن و سیستم عروقی در انسان است. این عفونتها بیشتر در افراد دارای بیماریهای زمینه ای مستعد کننده و دچار ضعف ایمنی مشاهده می گردد. گونه های کاندیدا به صورت طبیعی در پوست و مخاط حضور دارند. اگرچه کاندیدا آلبیکنس بعنوان شایع ترین گونه در ارتباط با ایجاد عفونت های قارچی جدی مطرح است، اما دیگر گونه های کاندیدا نیز به عنوان پاتوژن های فرصت طلب دارای اهمیت از نظر بالینی مطرح شده اند. گونه های کاندیدا دارای توانایی بالایی در بکار گیری فاکتورهای ویرولانس در جهت کلونیزاسیون، تهاجم و بیماری زایی می باشند. فاکتورهای ویرولانس اصلی شامل تشکیل بیوفیلم، فنوتایپ سویچینگ، تولید آسپارتیل پروتیناز، فسفولیپاز و غیره می باشد. آسپارتیل پروتیناز ترشحی بعنوان یکی از مهم ترین فاکتورهای ویرولانس گونه های کاندیدا در نظر گرفته شده است که باعث تقویت توانایی ارگانیسم در کلنیزه شدن و نفوذ در بافت های میزبان و تضعیف شدن سیستم ایمنی می گردد. این آنزیم توسط یک خانواده 10 ژنی شناخته شده تحت عنوان sap تولید می شوند که در بین گونه های مختلف بطور متفاوت توزیع شده اند.

جنس مالاسزیا (پیتروسپوروم) شامل 7 گونه قارچی وابسته می باشد که در اتیولوژی گروه متنوعی از عفونتهای قارچی به ویژه تینه آورسیکالر دخیل می باشند. تینه آورسیکالر یک عفونت قارچی سطحی مزمن و عودکننده است که بوسیله تولید ماکولهای هیپریاهیپوپیگمانته بر روی پوست انسان توصیف می گردد. فاکتورهای متعددی نظیر ژنتیک، تغییر میکروفلور پوست، اختلالات ایمنولوژیک و تغییرات اجزا لیپیدی سطحی در میزبان و تفاوتهای بین گونه ای در فعالیت آنزیمهای لیپاز و هیدرولاز در ارگانیسم های عامل از جمله عوامل احتمالی مستعدکننده عفونتهای مالاسزیایی می باشند. با این حال اطلاعات بسیار ناچیزی در رابطه با مکانیسم یا مکانیسم های دخیل در پاتوژنز این عفونتها به صورت مستند ارائه گردیده است. در تحقیق حاضر، تاثیر عصاره پیاز بر الگوی رشد و ویژگیهای آنزیم لیپاز در قارچ مالسزیا فورفور موردب ررسی قار رگفته است. در مراحل اولیه تحقیق ده ایزوله مالاسزیا فورفور که از بیماران مبتلا به تینه آورسیکالر جدا شده بودند، تحت شرایط مختلف کشت داده شدند. شرایط مناسب رشد و تولید انزیم لیپار در رابطه با عواملی نظیر ‏‎ph‎‏، دما ومدت زمان انکوباسیون به ترتیب برابر 8/5، 28 درجه سانتیگراد و 4 روز تعیین گردید. در مرحله بعد بهترین ایزوله تولیدکننده آنزیم لیپاز ‏‎‎‏(ایزوله 137) تحت شرایط مناسب تعیین شده در حضور غلظتهای مختلفی از عصاره آبی و روغن پیاز کشت داده شد. براساس نتایج به دست آمده مشخص گردید که مهار وابسته به غلظت رشد قارچی در حضور تمامی غلظتهای بکار رفته از عصاره پیاز با حداکثری برابر 73 درصد اتفاق می افتد، همچنین کاهش فعالتی ویژه آنزیم لیپاز در حضور غلظتهای مشخصی از هر دو نوع عصاره مشاهده شد. در مجموع نتایج به دست آمده نشان داد که عصاره آبی پیاز دارای ترکیبات ویژه ای است که رشد قارچی و فعالیت لیپاز را در مالاسزیا فورفور مهار می کند و بنابراین می توان از این عصاره به عنوان یک ترکیب در درمان عفونتهای مالاسزیایی بهره برد.