در سال های اخیر، سلول درمانی و مهندسی بافت اهمیت زیادی در درمان بیماری های کبدی داشته است. سلول های بنیادی با توجه به پتانسیل منحصر به فرد در تمایز و تزاید، به عنوان منبع سلولی مناسب، جایگاه ویژه ای در سلول درمانی یافته اند. به دلیل مشکلات مختلف استفاده از سلول های بنیادی جنینی، امروزه توجه زیادی به سلول های بنیادی بالغ معطوف شده است. در این تحقیق، از سلول های بنیادی با منشا مغز استخوان جهت تمایز به سلول های شبه کبدی با هدف بررسی تاثیر لامینین بر این فرآیند به عنوان یکی از مهم ترین اجزای ریزمحیطی کنام این سلول ها در شرایط فیزیولوژیک استفاده شده است. با این رویکرد، پس از تهیه سلول های بنیادی مزانشیمی از بانک سلولی پژوهشکده رویان، تایید بنیادی بودن این سلول ها از طریق آنالیز مارکرهای اختصاصی نظیر cd105, cd90, cd44 به روش فلوسیتومتری انجام پذیرفت. بیان بالای این مارکرها و عدم بیان مارکرهای cd45 و cd34 به ترتیب، مزانشیمی بودن و عدم آلودگی به سلول های هماتوپویتیک و لکوسیت ها را نشان داد. تمایزپذیری این سلول ها به سلول های چربی و سلول های استخوانی نیز پتانسیل تمایزی این سلول ها را اثبات کرد. پس از کشت این سلول ها، ابتدا مقایسه چسبندگی به روش رنگ سنجی و مقایسه تکثیر با استفاده از روش mtt و شمارش سلولی انجام پذیرفت. سپس، جهت مطالعه تاثیر لامینین بر روند تمایز کبدی، سلول های فوق بر روی سطح پلی استیرن و سطح پوشانده شده از لامینین در طی دو مرحله و به مدت 21 روز، جهت تمایز به سلول های شبه کبدی کشت داده شدند. طی روند تمایز، بررسی های مورفولوژیکی، بیان سیتوکراتین 18 (ck18) و 19 (ck19) به روشrt-pcr ، بیان آلبومین و آلفافیتوپروتئین به روش ایمونوسیتوشیمی، بررسی مارکرc-met به روش فلوسیتومتری، تولید اوره، ذخیره گلیکوژن و فعالیت آنزیم سیتوکروم اکسیداز در گروه کشت داده شده بر روی بستر لامینین در مقایسه با سطح پلی استیرن مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این تحقیق بیانگر تاثیر لامینین در افزایش چسبندگی و کاهش تکثیر سلول ها بود. همچنین بیان ck18 و عدم بیان ck19، بیان آلبومین و آلفافیتوپروتئین و حضور گلیکوژن در سلول های تمایز یافته در هر دو بستر و افزایش معنی دار تولید اوره و فعالیت آنزیم cyp3a4 در سلول های تمایز یافته روی بستر لامینین نسبت به پلی استیرن نشان داده شد (p 0.05). به طور کلی، نتایج حاصل از این تحقیق موید تأثیر لامینین در بهبود تمایز سلول های بنیادی انسانی با منشأ مغز استخوان به سلول های شبه کبدی بود. استناد بر این نتایج می تواند در بهبود طراحی داربست های مناسب در مهندسی بافت کبد راهگشا باشد.

چکیده رویکرد جدید محققین پس از مواجهه با مشکلات استفاده از سلول های بنیادی جنینی و بالغ در درمان، القای پرتوانی در سلول های سوماتیک است که با انتقال چهار فاکتور oct3/4، sox2، klf4 و c-myc انجام می گیرد. هدف از انجام این پروژه، تهیه و کلون نواحی رمزکننده این ژن ها از سلول های مرحله جنینی موش و انتقال آنها به ناقل های پستانداری برای انجام تحقیقات در خصوص تولید سلول های بنیادی القایی و زمینه های مشابه بود. عدم امکان دسترسی به این سازه ها و از طرف دیگر نیاز به راه اندازی و انجام یک سری تکنیک های سلولی و مولکولی در گروه، ما را بر آن داشت تا با پی ریزی تدریجی (علمی و تکنیکی) و تهیه این فاکتورها به طور بومی در زمینه ورود به بحث پرتوانی گام برداریم. برای انجام این کار، پس از جدا کردن جنین های موش در مرحله بلاستوسیست و مرحله 5/12 روزگی و همچنین کشت سلول های بنیادی جنینی، محتوای rna آن ها جدا شده و با روش rt-pcr ، منبع cdna از آن ها تهیه شد. سپس با پرایمرهای اختصاصی و بهینه کردن شرایط، cdna چهار فاکتور تهیه و در ناقل مناسب با ترانسفورماسیون باکتری، همسانه سازی شد. سپس جهت اطمینان از صحت توالی تعیین سکانس شده و پس از آن cdna هر فاکتور از ناقل تکثیری جدا شده و در ناقل بیانی مناسب پستانداری همسانه سازی گردید. پس از انجام اهداف این پروژه و ثبت پلی مورفیسم جدیدی از klf4 در پایگاه ncbi، بیان پروتئینی این فاکتورها نیز پس از ایجاد سازه ژنتیکی همراه با egfp برای klf4، با لیپوفکشن سلول های nih3t3 با این فاکتورها به طور جداگانه و انجام تکنیک های rt-pcr و ایمنوسیتوشیمی اثبات گردید. دیگر فاکتور پرتوانی به نام نانوگ نیز با روش های راه اندازی شده همسانه سازی شد.

ژن oct4 یکی از ژن های اصلی و محوری در خصوصیات پرتوانی و خودنوزایی سلولی است و بیان آن علاوه بر سلول های بنیادی، در نمونه های توموری سرطان های مختلف تایید گردیده است. این ژن دارای سودوژن های متعدد و سه واریانت پیرایشی oct4a، oct4b و oct4b1 است. واریانت oct4a نقش اصلی و محوری را در خصوصیت پرتوانی و خودنوزایی سلول های بنیادی سرطانی ایفا می کند و نقش واریانت oct4b هنوز مبهم است. oct4b1 جدیدترین واریانت پیرایشی oct4 بوده و بسیار شبیه oct4b می باشد. این واریانت جدید دارای رفتار بیانی مشابهی با واریانت oct4a در سلول های بنیادی و سرطانی رویانی است بطوریکه مانند oct4a، بیانش در هنگام تمایز به حداقل ممکن کاهش می یابد. به منظور افزایش اطلاعات در مورد نقش زیستی و شکل عملکردی این واریانت بیش بیان این واریانت جدید در سلول های کارسینومای رویانی موش (p19) و کارسینومای رویانی انسان (nt2) و سلول زیگوت موش انجام گرفت. نتایج حاصل نشان داد که بیش بیان این واریانت در سلول های p19 و nt2 و تکوین جنین موش تا مرحله بلاستوسیست هیچ گونه تاثیر فنوتیپی نداشته است اما موش های ترانسژنیک تولید شده دارای فنوتیپ غیرطبیعی بودند. سئوالات زیادی در ارتباط با فنوتیپ های مشاهده شده و واریانت جدید وجود دارد که لازم است در آینده مورد مطالعه قرار بگیرند.

piwil2، متعلق به خانواده piwi/argonate، پروتئینی است که از طریق مسیر سیگنالینگstat3/bcl-xl باعث مهار اپوپتوز و القاء تکثیر می شود و در تنوع وسیعی از فرایندهای سلولی از جمله خودبازسازی سلول های بنیادی زایا دخیل می باشد. بیان اکتوپیک piwil2 که در شرایط فیزیولوژیکی به صورت عمده تنها در بیضه پستانداران قابل مشاهده است، در بسیاری از سرطان ها محرز شده است و در مراحل مختلف سرطان پستان به ویژه در سلول های بنیادی (پیش) سرطانی دارای بیان پایدار می باشد. با این حال، هنوز نقش سببی این پروتئین در ایجاد و پیشرفت سرطان مشخص نشده است. با توجه به اینکه نقش(های) سببی piwil2 در فرایند سرطانزایی مورد بررسی قرار نگرفته است، می توان انتظار داشت که با ایجاد یک مدل مناسب برای این پروتئین، از یک سو، قابلیت piwil2 را به عنوان یک بیومارکر در تشخیص، پیشگیری و درمان به اثبات رساند و از سوی دیگر، نقش سببی این پروتئین را در ایجاد و پیشرفت سرطان پستان مورد بررسی قرار داد. در این تحقیق، با ایجاد رده های سلولی mef-piwil2 (سلول های فیبروبلاست جنینی موش بیان کننده piwil2) و mmec-piwil2 (سلول های اپی تلیالی بافت پستان موش بیان کننده piwil2)، تاثیر بیان این پروتئین بر تغییر رقتار سلول های مذکور مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بررسی های مولکولی تایید کننده نقش پرولیفراتیو و آنتی اپوپتوتیک این پروتئین و افزایش بیان pcna، stat3، bcl-xl در هر دو رده سلولی مذکور بود؛ همچنین بیان piwil2 در این سلول ها، باعث تغییر الگوی بیان بیومارکرهای بنیادی سرطانی (افزایش بیان cd44 و کاهش بیان cd24) شد. بنابراین، piwil2 در ایجاد سلول های بنیادی سرطانی (شروع سرطان) ایفای نقش می کند. در ضمن، در سلول های مذکور الگوی بیان snail، e-cadherin و vimentin یعنی بیومارکرهای تبدیل سلول های اپی تلیال به مزانشیال و بالعکس (epithelial to mesenchyal transition/mesenchyal to epithelial transition) نیز دچار تغییر شد که این موضوع حاکی از مداخله این پروتئین در مراحل پیشرفت سرطان به سمت وضعیت متاستاتیک می باشد. بعلاوه، سرطانزا بودن سلول های mef-piwil2، در شرایط in vitro و in vivo نیز به اثبات رسید. همچنین، طبق مشاهدات به عمل آمده در این تحقیق مشخص شد که piwil2 در شرایط مناسب قادر به القاء پرتوانی (induced pluripotent stem cells) در رده سلولی mef-piwil2 می شود؛ البته اثبات قطعی این موضوع نیازمند بررسی های بیشتر و دقیق تری است. ذکر این نکته شایان توجه است که احتمالا پروتئین مذکور بسته به نوع سلول، میزان بیان و شرایط محیطی سرنوشت های متفاوتی را برای سلول ها رقم می زند. درکل بر اساس نتایج حاصل از مطالعات مولکولی و نیز آزمون های عملکردی، می توان گفت که piwil2، در ایجاد جمعیت سلول های بنیادی سرطانی و در نتیجه شروع و پیشرفت سرطان به سمت وضعیت متاستاتیک دارای نقش(های) سببی مهمی می باشد.

انجماد رویان در مراحل مختلف تکوینی شامل زیگوت، مراحل اولیه ی تسهیم و بلاستوسیست، یکی از بخش های اصلی در اکثر برنامه های لقاح آزمایشگاهی است. به دلیل هماهنگی بهتر اندومتر و رویان و نیز نرخ لانه گزینی بالاتر بلاستوسیست، انجماد آن نسبت به سایر مراحل در ارجحیت قرار دارد. با این وجود حضور مایع درون حفره ی بلاستوسل و نیز تشکیل کریستال یخ، انجماد آن را با محدودیت روبرو ساخته است. لذا در این مطالعه، با خارج ساختن این مایع با کمک روش مکانیکی ریز سوزن و بررسی کیفیت بلاستوسیست از لحاظ سلولی و مولکولی، علاوه بر بهبود انجماد بلاستوسیست، سعی در بررسی ارتباط بین این روش و تغییر بیان ژن نمودیم. بدین منظور تعداد 421 بلاستوسیست برون تنی موش از نژاد nmri پس از انجام ivf، و کشت به مدت5/4 – 4 روز در محیط آزمایشگاه، به دست آمدند و به طور تصادفی به سه گروه تقسیم شدند. گروه اول پس از قرارگیری در محیط های انجماد، به وسیله ی کرایوتاپ درون ازت غوطه ور و سپس ذوب شدند. گروه دوم پس از انجام تکنیک سوراخ نمودن مصنوعی بلافاصله منجمد- ذوب گردیدند. سپس هر دو گروه از نظر زنده مانی، خروج از زونا و بیان ژن های eomes و cdx2 با نتایج گروه سوم (کنترل) مقایسه شدند. مقایسه نتایج سلولی نشان داد که انجماد موجب کاهش غیر معنادار نرخ زنده مانی و کاهش معنادار خروج از زونا شد. اما با ایجاد سوراخ در حفره ی بلاستوسل پیش از انجماد، میزان خروج از زونا به طور معنی دار و میزان زنده مانی نیز به طور غیر معنادار افزایش نشان داد. همچنین بیان ژن های eomes و cdx2 پس از انجام سوراخ نمودن مصنوعی، نسبت به تیمار انجماد تنها، کاهش یافت که این نتیجه به بیان ژن کنترل نزدیک تر بود. براساس یافته های این تحقیق، خروج آب توسط روش مکانیکی ریز سوزن توانست کیفیت بلاستوسیست را پس از انجماد افزایش دهد. واژگان کلیدی: بلاستوسیست موش، سوراخ نمودن مصنوعی، انجماد شیشه ای، ژن های cdx2 و eomes