هورمون محرک فولیکول گاوی (fsh) به خانواده هورمون های گلیکوپروتئینی تعلق دارد که از غده هیپوفیز یا جفت ترشح می شوند. این هورمون یک هترو دایمر می باشد که از زیر واحد آلفا (مشترک در همه هورمون های گلیکوپروتئینی) و زیر واحد بتا (اختصاصی هر هورمون) تشکیل شده است. fsh گاوی در تکنولوژی تولید مثل، مانند سوپراوولاسیون حیوانات مزرعه ای و درمان سندرم پلی سیستیک تخمدان استفاده می شود. همچنین این هورمون برای اهدف بالینی، دامپزشکی و درمان ناباروری کاربرد دارد. تکنولوژی dna نوترکیب ابزار مفیدی جهت تولید fsh عاری از آلودگی های هورمونی، پریونی و ویروسی فراهم می کند. تولید پروتئین نوترکیب در سیستم های بیان یوکاریوتیک مثل pichia pastoris یک روش مطمئن برای تولید fsh گاوی با اهداف درمانی است. همچنین شناسایی پروتئین تولید شده به صورت نوترکیب، توسط آنتی بادی ویژه، صحیح بودن ساختار تغییرات پس از ترجمه پروتئین را تایید می کند. هدف این تحقیق تولید هورمون fsh گاوی در سیستم بیانی pichia pastoris بود. برای این منظور orf کد کننده دو زنجیره آلفا و بتای ژن fsh گاوی به طور جداگانه در وکتور ptz57r/t کلون شد سپس در وکتور بیانی ppic9 ساب کلون گردید و در نهایت توسط واکنش pcr و تعیین توالی تایید شد. دو پلاسمید نوترکیب حاوی زنجیره آلفا و بتا به ترتیب با آنزیم های محدود کننده sali و saci که ایجاد فنوتیپ his+ mut+ gs115 می کنند، خطی شدند. محصول ایجاد شده داخل سلول مستعد مخمر با الکتروپوریشن کوترانسفکت شد و حضور آن در سلول توسط pcr تایید گردید. در ادامه چند کلون جهت بررسی بیان انتخاب شد. سپس، رسوب سلولی کلون های انتخابی در محیط bmmy سوسپانسیون شد و به مدت 4 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد قرار گرفت. در طول دوره انکوباسیون، متانول به عنوان القاگر با حجم نهایی 5/0 درصد هر 24 ساعت اضافه شد و هر 6 ساعت نمونه برداری انجام گردید. بیان هورمون fsh گاوی بصورت نوترکیب در محلول رویی و رسوب سلولی مخمر، با تکنیک pcr و وسترن بلات تایید شد.

هورمون محرک فولیکول، پروتئینی دوبخشی است که از زیر واحد آلفا و بتا تشکیل شده است. این دو زیر واحد با پیوند غیر کووالانسی به هم مرتبط هستند. هورمون fsh نقش مهمی در تنظیم بلوغ تخمک بازی می کند و یک عنصر کلیدی برای رشد فولیکول در تخمدان میش می باشد. هدف این مطالعه کلون و بیان زیر واحدهای هورمون محرک فولیکول گوسفندی در مخمر pastoris pichia است. برای این منظور ژن های دو زنجیره آلفا و بتا fsh گوسفندی از طریق استخراج rna از سلول های هیپوفیز قدامی گوسفندی جداسازی و cdna آنها ساخته شد. با کمک پرایمرهای اختصاصی ژن، ناحیه orf هر دو زنجیره تکثیر و در وکتور ptz57r/t کلون شدند. سپس ژن نوترکیب در وکتور بیانی pic9 ساب کلون و توالی یابی شد. پس از کشت سلول های مخمر، وکتور نوترکیب حاوی زنجیره آلفا و وکتور نوترکیب حاوی زنجیره بتا به روش الکتروپوریشن به درون سلول مخمر p. pastoris کوترانسفکت شدند. بیان پروتئین نوترکیب با القا متانول 5/0 درصد حجم کل در هر 24 ساعت صورت گرفت. صحت قرار گیری ژن fsh در ژنوم مخمر توسط pcr با پرایمرهای aoxi و پرایمرهای اختصاصی ژن بررسی شد. در نهایت، حضور ژن fsh گوسفندی توسط sds-page و وسترن بلاتینگ مورد بررسی قرار گرفت. در نتیجه بیان هورمون نوترکیب fsh گوسفندی با پپتید نشانه آلفا فاکتور- پپیتید نشانه طبیعی ژن در میزبان مخمر متیلوتروفیک پیکیا پاستوریس امکان پذیر است. بنابراین این سیستم یک میزبان قابل اعتماد برای تولید fsh گوسفند است.

پس از آنکه mrna از غده هیپوفیز اسب نژاد توربرد ایرانی استخراج شد، برای سنتز cdna استفاده گردید. هر یک از زیرواحد های پروتئین fsh ، با استفاده از دو جفت آغازگر اختصاصی تکثیر یافتند و سپس بطور جداگانه در حامل ptz57r.t کلون شدند. حامل های نوترکیب به درون سلول باکتری ? dh5منتقل شدند. کلون سازی زیرواحد ها با استفاده از آزمون های تاییدی نظیر واکنش هضم آنزیمی و تعیین توالی، تایید شد. در ادامه توالی های نوکلئوتیدی? و ? از حامل باکتریایی خارج و سپس درون حامل بیانی ppic-9 کلون شدند. دو سازه نوترکیب مجددا در میزبان باکتریایی ? dh5تکثیر یافتند و سپس استخراج گردیدند. سازه نوترکیب ppic-9/fsh? با استفاده از آنزیم برشی sali و سازه نوترکیب ppic-9/fsh? با استفاده از آنزیم برشی saci خطی شدند و بطور همزمان طی فرآیند الکتروپوریشن به درون ژنوم سلول مخمر پیکیاپاستوریس درج گردیدند. سلول های ناقل هر دو زیرواحد با کمک واکنش pcr بر روی ژنوم سلول مخمری تایید و مشخص گردیدند؛ و در محیط کشت بیانی bmmy حاوی متانول کشت داده شدند. نتایج خوانش توالی نوکلئوتیدی زیرواحد fsh? نشان داده است که در ناحیهutr َ 3هورمون مورد مطالعه نسبت به گزارشاتی که تاکنون ثبت شده است، چند تفاوت نوکلئوتیدی مشاهده می شود؛ این تفاوت ها شامل اضافه شدن سه نوکلئوتید در موقعیت 418-413 جفت باز و تغییر یک نوکلئوتید در موقعیت 443 جفت باز می باشد. در این مطالعه، بیان پروتئین نوترکیب fsh اسبی در سیستم ترشحی مخمر پیکیاپاستوریس با استفاده از آزمون های sds-page، وسترن بلاتینگ و رسوب دهی ایمنی تایید شد. این تحقیق نشان داده است که پیکیاپاستوریس سیستم مناسبی برای تولید پروتئین fsh اسبی می باشد و شناسایی پروتئین موردنظر با آنتی بادی اختصاصی نشان دهنده ی انجام اصلاحات پس ترجمه ای صحیح این پروتئین در این سیستم بیانی می باشد

هورمون های گنادوتروپینی از جمله هورمون لوتئینه کننده ( lh) به خانواده ی هورمون های گلیکو پروتئینی تعلق دارند، این هورمون های گلیکوپروتئینی مولکول های هترودایمری هستند که از دو زیرواحد متفاوت به نام زیرواحد عمومی ? و زیر واحد اختصاصی ? تشکیل شده اند و به طور غیر کووالانت و با پیوندهای هیدروژنی و واندروالسی به هم متصل اند. بخش کربوهیدراتی هورمون های گلیکوپروتئینی مهم ترین نقش را در پتانسیل زیستی هورمون بازی می کند. این هورمون در رشد و بلوغ اندام های جنسی و صفات ثانویه جنسی موثر است و عملکرد آن برای بیوسنتز استروئید در تخمدان، تخمک گذاری، ایجاد جسم زرد در زنان و همچنین در محصولات آندروژنی حاصل از سلول های لیدیگ بیضه ای که موجب ساخت و ترشح تستوسترون در مردان می شود، با اهمیت است. ترشح این هورمون از هیپوفیز و در مواردی از جفت می باشد. با توجه به نقش lh در باروری و ایجاد صفات ثانویه ی جنسی، تزریق خارجی این هورمون می تواند اختلالات ناشی از بیماری های هیپوگنادیسم را کاهش دهد. lh در حال حاضراز دو راه ادراری و نوترکیب فرآوری می شود. سیستم بیانی در سلول تخمدان همسترچینی (chinese hamster ovary cell) علاوه بر دارا بودن مزایای سیستم ecoli، نظیر سطح بالای بیان، مزایای سیستم یوکاریوتی نظیر اصلاحات پس از ترجمه و گلیکولیزاسیون مناسب را دارا می باشد، که این ویژگی ها سیستم را برای تولید بالای پروتئین نوترکیب یوکاریوتی منحصر به فرد کرده است. در این تحقیق ابتدا ژن lh انسانی در میزبان باکتریایی کلون سازی و سپس ژن برش خورده و درون ناقل بیانی متناسب با سلول میزبان (cho ) کلون گردید. پس از انتقال به ژنوم سلول و تأیید نوترکیب بودن سلول های ترانسفورم شده، بیان هورمون نوترکیب با استفاده از روش های sds-page و وسترن بلاتینگ تأیید شد.

چکیده هورمون محرک فولیکولی گوسفندی (ofsh) یک هورمون گلیکوپروتئینی است که از غده هیپوفیز قدامی ترشح می¬شود و نقشی اساسی در عملکرد سیستم تولید مثلی مهره¬داران ایفا می¬کند. این هورمون یک هورمون هترودایمریک شامل دو زیر واحد آلفا با 92 اسید آمینه و بتا با 111 اسید آمینه است که به¬صورت غیر کوالانسی بهم متصل¬اند. مخمر متیلوتروپ پیکیاپاستوریس یک میزبان ایده¬آل برای تولید پروتئین خارجی است. این مخمر به¬عنوان اقتصادی¬ترین سیستم بیانی یوکاریوتی برای ترشح پروتئین خارجی به داخل محیط کشت شناخته شده است. هدف از این طرح بهینه¬سازی بیان ژن fsh گوسفندی در مخمر پیکیاپاستوریس بود که توسط تنظیم و تغییر شرایط کشت مانند دما، درصد القای متانول، اسیدیته و ظرف کشت میسر می¬شود. برای انجام این تحقیق ابتدا فرایند بیان در یک دوره انکوباسیون 5 روزه در دماهای مختلف (15-18-21-24-27-30-32)، درصد¬های مختلف القای متانول (5/%0-%1-%2-%3)، اسیدیته (4-5-6-7-8) و ظروف کشت متفاوت (زاویه¬دار و بدون زاویه) با سه تکرار انجام شد. پس از پایان فرایند بیان پروتئین نوترکیب ترشح شده در محیط کشت توسط روش tca تغلیظ شد و سپس سطوح بیان در شرایط مختلف محیط کشت با استفاده از تکنیک¬های sds-pade و وسترن بلاتینگ مورد ارزیابی قرار گرفت. نهایتا دما، القای متانول، اسیدیته و ظرف کشت مناسب در طول فرایند بیان ژن، انتخاب شد. نتایج حاصل از sds-page و وسترن بلاتینگ باند پروتئینی تقریبا 18 کیلو دالتون را در محدوده مورد نظر نشان داد. این نتایج نشان داد که تاثیر پارامترهای محیطی روی بیان پروتئین قابل مشاهده است. همچنین این بررسی نشان داد که بهینه¬ترین شرایط کشت، دمای30 درجه سانتیگراد، القای متانول 5/0 درصد، اسیدیته 6 و ظرف کشت زاویه دار (بافل فلاسک) بود.

هدف از این مطالعه بررسی تاثیر پارامتر های مختلـف مانند دما، درصد القای متانول، اسیدیته، اکسیـژن محـلول و ظـرف کشـت روی بیان پروتئین fsh گاوی نوترکیب در مخمر متیلوتروپیک پیکیا پاستوریس بود. در این پروژه پروتئین fsh گاوی نوترکیب در سیستم بیانی پیکیا پاستوریس با استفاده از محیط کشت در دماهای 15، 18، 21، 27، 30 و 32، phهای 4، 5، 6، 7 و 8، درصدهای مختلف القای متانول 5/0، 1، 2 و 3 درصد و میزان اکسیژن محلول در نرخ 35 درصد و یک دوره زمانی 5 روزه در ظروف کشت متفاوت (ارلن، بافل فلاسک) تولید شد. پروتئین های نوترکیب با روش tca تغلیظ شدند و سپس با استفاده از تکنیک sds-page و وسترن بلاتینگ ارزیابی شدند و باند در ناحیه 16 کیلو دالتون مشاهده شد. نتایج نشان داد که میزان بهینه تولید پروتئین نوترکیب در دمای 30 درجه، 6ph=، غلظت 1 درصد متانول و در ظروف کشت زاویه دار با نرخ اکسیژن محلول در 35 درصد است.

هورمون محرک فولیکولی انسانی، یکی از اعضای خانواده ی هورمونهای گنادوتروپینی است. این هورمون گلیکوپروتئینی مانند دیگر اعضای این خانواده، ماکرومولکولی هترودایمر است که از دو زیرواحد تشکیل شده است. زیرواحد عمومی مشترک در تمام اعضای این خانواده و زیر واحد دیگر نامیده می شود. این هورمون بطور طبیعی در باروری زنان و مردان نقش دارد و به عنوان دارو در درمان ناباروری بطور گسترده ای استفاده می گردد. تولید صنعتی این دارو امروزه به دو صورت نوترکیب و استخراجی از ادرار زنان یائسه صورت می گیرد. تولید این هورمون بصورت نوترکیب و با کمک مهندسی ژنتیک مزایایی نسبت به نوع استخراجی از ادرار دارد که از آن قسم می توان مواردی مانند عدم آلودگی باهورمون lh ، عدم آلودگی با عوامل بیماریزای ویروسی و پریونی و همچنین خالص سازی آسان تر را نام برد. در نتیجه تمایل به تولید این دارو بصورت نوترکیب روز به روز افزایش یافته است. تولید این دارو در مقیاس صنعتی هنگامی دارای توجیه است که با کمترین هزینه ممکن، و با بیشترین بازده انجام پذیرد. بدین منظور در این مطالعه سعی شده است که برای کاهش هزینه تولید، تاثیر کاهش میزان سرم جنین گاوی محیط کشت سلول های نوترکیب cho به عنوان یکی از گرانترین ترکیبات محیط کشت، بررسی گردد. علاوه بر این برای بالا بردن میزان بیان این هورمون شرایط محیط کشت مانند دما و ph مد نظر قرار گرفته است. در این مطالعه با تغییر دما در بازه (c°37-c°28) و ph در بازه (6/7-7/6)، دما و ph ای که در آن بیشترین بیان وجود دارد تعیین گردید و در انتها تاثیر این دو عامل بطور همزمان بر میزان بیان هورمون بررسی شد. و مشاهده گردید با تاثیر ph و دمای بهینه ی در این آزمایش که به ترتیب 7 و c°28 می-باشد و در محیط حاوی 3%fbs میزان بیان را تا 14 برابر افزایش داد.