اینوزیتول تری فسفات ip3)) یک پیام بر ثانویه است که با هیدرولیز فسفاتیدیل اینوزیتول 4،5- بیس فسفات توسط فسفولیپاز-c تولید می شود. ip3 نقش مهمی در آزاد سازی کلسیم از ذخایر سلولی دارد. خروج کلسیم داخل سلولی از طریق اتصال ip3به پروتئین گیرنده غشایی ip3 و باز شدن کانال های روی غشا انجام می شود. اختلال در این مسیر، منجر به اختلالات متابولیسمی و به دنبال آن بسیاری از بیماری های متابولیکی می شود. اهمیت متابولیکی این مولکول، ساخت یک سنسور زیستی را جهت شناسایی آن مورد توجه قرار می دهد. یکی از روش های جدید بررسی عملکرد پروتئین ها و ترکیبات درون سلول، استراتژی مکمل سازی قطعات پروتئین های گزارشگر(protein-fragment complementation strategy) است. برای سنجش مولکول های زیستی کوچک، با تعبیه کردن دمین های حامل جایگاه اتصال مولکول مورد نظر درون ساختار پروتئین های گزارشگر، سنسورهای زیستی ایجاد می شود. این سنسورهای زیستی قابلیت ردیابی ترکیبات سلول را داشته و با میانکنش مولکول هدف با جایگاه اتصال خود، سنسور نشر نور خواهد داشت. سنسور طراحی شده در این رساله متشکل از دمین هسته اتصال به ip3 بوده که در بین قطعات جدا شده لوسیفراز قرار گرفته است. اتصال ip3 به جایگاه خود منجر به تغییرات کانفورماسیونی شده و باعث بازآرایی پروتئین گزارشگر لوسیفراز و متعاقب آن نشر نور می شود. سازه ساخته شده به داخل سلول hek293t انتقال یافته و در حضور ip3 میزان فعالیت آن بررسی شد. نتایج نشان داد که اتصال لیگاند منجر به نشر لومینسانس می شود. اگرچه سنسور ساخته شده دارای فعالیت پایه است اما نسبت سیگنال در حضور ip3 به طور قابل توجهی از فعالیت پایه آن در عدم حضور ip3 بالاتر است. سیگنال در سیستم in vitro حدود 11 برابر و در حضور القاکننده های رهایش ip3 در سلول زنده (living cell) حدود 8 برابر قوی تر از فعالیت پایه است.

واکنش آنزیمی بیولومینسانس با دخالت آنزیم لوسیفراز توسط کاتالیز اکسیداسیون لوسیفرین (lh2) در حضور atp و mg2+ و مولکول اکسیژن رخ داده و منجر به نشر نور می شود. لوسیفراز به-طور گسترده ای به عنوان گزارشگر مورد استفاده قرار می گیرد زیرا دارای حساسیت بالا و گستره فعالیت خطی است. نیاز روزافزون به آنزیم های سازگار از نظر اقتصادی و صنعتی در زیست شناسی، بیوتکنولوژی و پزشکی توجه بسیاری از پژوهشگران را به خود جلب کرده است. روش های متعددی برای افزایش پایداری حرارتی پروتئین به کار می رود. در این مطالعه، روش جهش زائی هدفمند به عنوان یک روش منطقی برای جایگزینی گلوتامیک اسید 428 به گلوتامین و لیزین انتخاب شده است. مطالعات دینامیک مولکولی انجام گرفته روی لوسیفراز گونه photinus pyralis نشان داده است که چگالی زیاد بار منفی در این موقعیت آن را انعطاف پذیر کرده است. بنابراین انعطاف پذیری آنزیم از طریق جایگزینی با اسید آمینه های هم اندازه اما با بار متفاوتی چون لیزین (بار مثبت) و گلوتامین (قطبی بدون بار) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان دادند که جایگزینی لیزین باعث کاهش فعالیت، فعالیت ویژه و پایداری حرارتی شده در حالی که جایگزینی گلوتامین رفتاری مشابه با پروتئین نوع وحشی دارد. مطالعات سینتیکی نشان داد که میزان km برای atp برای هر دو جهش یافته نسبت به نوع وحشی افزایش یافته، که نشان دهنده کاهش تمایل آنزیم به atp می-باشد، در حالی که میزان تمایل آنزیم به لوسیفرین در جهش یافته e428q افزایش یافته ولی در جهش یافته e428k تغییر محسوسی ندارد. بررسی های ساختاری، فشردگی ساختار آنزیم لوسیفراز در مورد جهش یافته e428k را تایید می کند که منجر به کاهش ساختار منظم در پروتئین می شود. در مورد جهش یافته e428q این تغییرات ساختاری موضعی بوده و منجر به باز شدن ساختار آنزیم شده است.

کلسترول اکسیداز ( cho, ec 1.1.3.6) یک الکل دهیدروژناز/ اکسیداز متعلق به خانواده ی گلوکز -متانول-کولین (gmc) اکسیدوردوکتاز و وابسته به فلاوین آدنین دی نوکلئوتید (fad) است که اکسیداسیون کلسترول (cholest-5-en-3?-ol) را با مصرف اکسیژن مولکولی برای ایجاد cholest-4-en-3-one و پراکسید هیدروژن (h2o2) کاتالیز می کند. با توجه به ویژگی سوبسترایی و فعالیت، کلسترول اکسیداز مشتق شده از سویه های استرپتومایسس در کیت های سنجش کلسترول مورد استفاده قرار می گیرند. در این تحقیق نیز از یک سویه ی بومی استرپتومایسس استفاده شد. ژن مورد نظر پس از تکثیر، در وکتور بیانی pet28a کلون و در باکتریdh5? e.coli انتقال یافت و آنالیز توالی انجام گرفت.بیان پروتئین در سویه bl21 e.coli مورد بررسی قرار گرفت، از آنجایی که درصد بالایی از پروتئین به شکل اجسام توده ای بیان می شدند، به منظور افزایش بیان پروتئین به فرم محلول شرایط مختلف دمایی، زمانی و میزان القاکننده iptg در سویه های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. پس از بهینه سازی شرایط بیان، تخلیص آنزیم، با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل-سفاروز انجام و فعالیت آنزیم سنجیده شد.

چکیده ندارد.